Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01HL056046 till PAL och K99HL116769 till AJT), och The Research Institute vid Nationwide barnsjukhus (PAL och AJT).

Etik uttalande: Studien genomfördes i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer, och det godkändes av institutionen Animal Care och användning kommittén vid Nationwide Barnsjukhus. 1. Förberedelse / Konfigurera Notera: Denna isoleringsteknik kräver två Langendorff värmeslingor placerade sida vid sida på en ringstativ, och parallellkopplad med ett cirkulerande vattenbad. <ol><li> Slå på cirkulerande vattenbad och justera temperaturen för att uppnå en sluttemperatur av 33-34 ° C...

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

Syftet med denna studie var att anpassa befintliga cellisoleringsprotokoll för att öka utbytet av koronar vaskulär glatt från murina hjärtan. Mest av pionjärarbete i vaskulär glatt muskulatur biologi utfördes med odlade råttaortaglattmuskelceller. Dessa studier förutsatt grundläggande kunskap om molekylära mekanismer som styr VSMC tillväxt, migration och hypertrofi 7. Eftersom området fortskred, blev det uppenbart att VSMC fenotyp och funktion kontrollerades av ett antal kärlbädd specifika fak...

Målet med denna metod är att isolera vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från den murina kranskärlscirkulation för användning i cellkultur och standardcellodlingsanalyser. Vi utvecklat denna teknik för att bedöma de molekylära mekanismer för vaskulär remodellering vid diabetes. Vi har tidigare rapporterat inåt hypertrofisk remodellering i septala arteriolerna i db / db-musmodellen av diabetes 1. På grund av den begränsade mängden vävnad som finns i de murina septala kranskärlen, standard experimentella tekniker undersöker proteinförändringar (t.ex. western blot) i db / db och kontrollmöss är svårt i bästa fall. Dessutom har vi tidigare visat att angiotensin-receptorblockerare (ARB) losartan minskar remodeling observeras i db / db-möss 2. Därför isolering av primära VSMC från krans cirkulationen ger oss möjlighet att ytterligare undersöka förändringar i VSMC fenotyp eller aktiverade signalvägar i diabetiska möss, som kan vara contributing till negativa hjärt arteriole ombyggnad. Ett flertal studier har klar kanoniska signalvägar med användning av VSMC isolerade från gnagare aorta, snarare än i varje specifik kärlbädd. Emellertid har vi visat vaskulär bädd specifik remodellering i krans, aorta, och mesenteriska cirkulationerna db / db-möss 1, vilket tyder de VSMC i varje kärlbädd kan vara olika. Därför är det nödvändigt att isolera VSMC från varje kärlbädden för att bättre förstå de patologiska förändringar som sker i varje uppsättning av VSMC. Det finns en uppsjö av olika metoder för att isolera och odla aorta VSMC. Men för närvarande finns det bara en studie som har publicerats på isoleringen av VSMC från mus kranskärlscirkulation 3. Teng et al. var först med att rapportera en metod för att isolera VSMC från mus kranskärlscirkulation; Men, har vi ändrat protokoll avsevärt eftersom de isolerade också endothelial cells. Andra laboratorier har också använt protokoll från Teng et al. Att isolera kransartärmuskelceller och luftvägarnas glatta muskelceller 4,5. Förändringarna vi har införlivat kommer att ge en population av celler höganrikat för VSMC från kranskärlscirkulation. Den retrograd perfusion av den isolerade däggdjurs hjärta, eller Langendorff teknik, grundades 1897 6 av Oscar Langendorff och fortfarande används i stor utsträckning idag för isolering av hjärt-celler. Tekniken som presenteras här, tillsammans med utvecklingen av moderna murina genetiska modifieringar, ger ett värdefullt verktyg för närmare undersökning av den molekylära beteende VSMC från kranskärlscirkulation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Medan isolering och odling av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från stora fartyg är väl etablerad, försökte vi isolera och kultur VSMC från kranskärlscirkulation. Hjärtan med intakta aorta valv avlägsnades och perfunderades via retrograd Langendorff med matsmältningen lösning innehållande 300 enheter / ml kollagenas typ II, 0,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor och 1 M CaCl2. De perfusat uppsamlades vid 15 minuters intervall under 90 min, pelleterades genom centrifugering, återsuspenderades i plating media, och ströks ut på vävnadsodlingsskålar. VSMC kännetecknades av närvaron av SM22α, α-SMA, och vimentin. En av de viktigaste fördelarna med att använda denna teknik är möjligheten att isolera VSMC från krans cirkulationen hos möss. Även ett litet antal celler erhållna kan begränsa några av de tillämpningar för vilka cellerna kan utnyttjas, kan isolerade koronar VSMC användas i en mängd olika väletablerade cellodlingstekniker och assays. Studier som undersöker VSMC från genetiskt modifierade möss kan ge ytterligare information om struktur och funktion och signal processer i samband med vaskulära patologier.

På grund av den ny aspekt av vår koronar VSMC isoleringsteknik, sökte vi att bestämma renheten hos den cellisolering. Mus koronar VSMC identifierades baserat på deras morfologi och immunofluorescensfärgning upp till passagen 2. Baserat på morfologin för cellerna i odling efter den första tvätten, isoleringsförfarandet avlägsnar effektivt hjärtmyocyter och endotelceller. De VSMC behålla sin morfologi upp till passage 2 (Figur 1). Men det finns en risk för k...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Syftet med detta protokoll är att demonstrera isolerings- och odlingstekniker i murina primära vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från kranskärlscirkulation. När VSMC har isolerats, kan de användas för många vanliga odlingstekniker.

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering och differentiering av stromal vaskulära celler till beige / Brite celler

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Mätning av kalcium Fluktuationer Inom sarkoplasmatiska retiklet av odlade glatta muskelceller Använda FRET-baserade Confocal avbildning

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering av mus koronära endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...