Name: a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Leverhulme Trust, инженерным и физическим научным исследованиям Совета [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Болезнь Альцгеймера Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] и Совет по медицинским исследованиям [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Мы благодарим Е. Авезовым и М. Лу для трансфекции LifeAct-GFP и цитозольная-GFP клеток соответственно, и W. Chen для подготовки культуры HEK293. Мы также благодарим К. O&#39;Holleran за помощь в разработке микроскопа, и Л. Шао и Р. Heintzmann за полезные обсуждения и предложения.

<ol>
	<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement.">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li><li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation.">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy.">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li><li>Esbj&#246;rner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observations+of+amyloid+&#946;+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A&#946;(1-40)+and+A&#946;(1-42)+aggregation.">Direct observations of amyloid &#946; Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of A&#946;(1-40) and A&#946;(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li><li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology.">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li><li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Super-Resolution+Imaging+of+&#946;-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo:+Method+and+Techniques.">Optical Super-Resolution Imaging of &#946;-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li><li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves.">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li><li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+resolution+wide-field+optical+imaging:+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li><li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination.">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li><li>Brunstein, M., Wicker, K., H&#233;rault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks.">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li><li>F&#246;rster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator.">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).</li><li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fastSIM:+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy.">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).</li><li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples.">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li><li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).</li><li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy.">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).</li><li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space.">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).</li><li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy.">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li><li>Str&#246;hl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data.">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).</li><li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns.">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li><li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm.">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915 (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Пользовательские встроенные системы TIRF-SIM, такие как настройки подробно в данном протоколе способны многоцветной супер-разрешением изображения на высокой скорости по сравнению с коммерчески доступными микроскопов. Бесспорное преимущество SIM в качестве метода сверхвысокого разрешения является то, что временное разрешение не ограничивается фотофизике флуорофора, по сравнению с другими методами, такими как одна молекула локализации микроскопии (SMLM) или методов сканирования точек, таких как стимулируется обеднения выбросов микроскопии ( STED). В отличие от этих других методов, SIM не требует фотопереключаемых или истощаемых флуорофоры так многоцветной визуализации проста. Номера системы TIRF-SIM, такие как оптический секционирования SIM и мультифокальной SIM обычно может добиться улучшения разрешения в 1,7 раза или менее на практике, в отличие от фактора 2 улучшения сообщили здесь, и коммерческие системы также часто медленнее и менее гибким, чем система представленные в этом протоколе. &quot;&gt; Две основные трудности в реализации этой техники, во-первых, необходимость для точного позиционирования шести SIM-лучей в пределах зоны МДП задней апертуры объективной, которая требует трудоемкой и требует много времени оптическую процедуру выравнивания. Во-вторых, для получения высокой контрастности картины в образце, поворота плоскости поляризации имеет важное значение. для малых систем NA 2D-SIM, вращение поляризации можно избежать путем тщательного выбора ориентации линейной поляризации, но это становится невозможным для TIRF-SIM 25. для получения изображений многоцветной высокоскоростной, электро- оптический контроль поляризации необходимо, и это увеличивает сложность и стоимость системы. Ограничения метода TIRF-SIM, как обычные TIRF, естественно ограничивается наблюдением биологических структур и процессов, расположенных на базальной мембране клетки, которые могут быть освещаемой глубины проникновения в 150-200 нм исчезающего поля. В то время какSIM - часто цитируется как менее photodamaging к клеткам , чем либо STED или SMLM, латеральное разрешение Удвоение ли еще увеличить требуемое число фотонов , по крайней мере , в 4 раза по сравнению с 5 обычными TIRF микроскопии. Для получения изображений при высокой частоте кадров с короткими выдержками времени, это увеличение фотонов требует использования повышенных освещенностей. Хотя любой флуорофор может быть использован для SIM-визуализации фиксированных или медленных движущихся образцов, высокая яркость флуоресцентных белков или следующего поколения синтетических красителей с повышенной светостойкости рекомендуются для получения изображений живых клеток. Несмотря на то, что эта реализация способна визуализации одного цвета с частотой кадров SIM свыше 20 Гц, многоцветные изображения в представленной системе ограничена временем переключения моторизованной эмиссионного фильтра колеса. Из-за большого размера чипа камеры sCMOS, использование фильтра эмиссии многополосные и изображения расщепления оптики было бы и разрешить одновременное Imaging с несколькими длинами волн при скорости не штрафа. Другой возможностью было бы чередовать различные лазеры возбуждения и использовать многополосный режекторный фильтр, чтобы отказаться от возбуждающего света. Использование бинарной сегнетоэлектрической SLM в этом варианте осуществления, также не является оптимальным. Дифракционная эффективность такого ОДС очень низка, так что большая часть падающего света в отражении нулевого порядка, который отфильтровывается пространственной маской. Для применений, требующих очень высокую частоту кадров, скорость формирования изображения, таким образом, ограничена выходной мощности лазерного диода. ОДС также вносит некоторую эллиптичность в поляризации для длин волн вдали от 550 нм расчетной длины волны, где пиксели не работают в идеальных полуволна пластин. Хотя это может быть компенсировано за счет использования дополнительного LCVR, идеальным решением может быть использование цифрового микрозеркальное устройства (DMD) в качестве генератора шаблона. Возможные модификации Установка Presented здесь является гибким и более легко модифицировать , чем коммерческие инструменты , так что другие методы визуализации , такие как 3D-SIM, быстрая 2D-SIM, мультифокальной SIM (MSIM) и нелинейном SIM (NL-SIM) могут быть реализованы 21,34,35. 2D-SIM может быть хорошо подходит для работы с изображениями относительно плоский, быстро движущихся структур, таких как периферической эндоплазматической сети. Периферийное ER лежит глубже внутри клетки, чем может быть освещена с помощью мимолетную поле TIRF, но благодаря своей плоской конструкции могут быть отображены с использованием стандартного 2D-SIM с незначительным фоном не в фокусе. Кроме того, использование улучшенных алгоритмов реконструкции оптических секционирования для подавления вне фокуса света расширить использование 2D-SIM для оптически толстых образцов, хотя и где осевое разрешение Удвоение не требуется 21. В MSIM образец освещается редкой решеткой возбуждения очагов 36. Эта модальность может быть реализован путем простого удаления пространственной маски (СМ) И заменив его на поляризатор. ПОМ в настоящее время работает как амплитудный модулятор. Бинарные решетками SIM, отображаемые на SLM могут быть заменены 2D-решетки пятен, с размером пятен, выбранных, чтобы быть равным размеру дифракционного ограниченного фокуса в плоскости изображения. На фиг.7А, решетка из 4 - х 4 пикселя квадратов отображается на ОДС (вставка) , который , когда на , уменьшенной пробе генерирует ограниченную дифракционную фокусы 150 х 150 нм, учитывая физический размер ОДС пикселя 13,62 мкм. Очаги возбуждения, то можно перевести сдвигая решетчатый узор на SLM и это повторяется несколько раз для того, чтобы осветить все поле зрения. Изображения приобретаются для каждого переведенного позиции шаблона и стек после обработки для получения реконструированного изображения с улучшенным разрешением до фактора <img alt="Уравнение" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> и снижение вне фокуса света по сравнению с эквивалентной Widefield изображения30. Эта модальность может быть полезно для получения изображений толстые, плотные образцы , для которых стандарт SIM - непригодна, например , с низкой контрастностью структур , таких , как окрашенными красных кровяных телец (рис 7c), хотя время обнаружения увеличивается из - за большого количества необработанных кадров требуется на поле зрения (в данном случае N = 168). И, наконец, установка может быть изменена для того, чтобы либо высокой NA линейный TIRF-SIM или с рисунком активации нелинейную SIM (PA NL-SIM), представленный недавно Ли и др., С использованием сверхвысокой 1.7 цели НС или дополнение фотоактивации лазера 405 нм и тщательной оптимизации решетки моделей SLM 35. Будущие приложения SIM-прежнему быстро развивается техника и многие приложения в области наук о жизни будет включена в будущем. Скорость, разрешение, и улучшения контраста техники и возможность использования стандартных флуорофоров мЕАН что для биоимиджинга, SIM устанавливается для замены обычных многих систем микроскопа, таких как конфокальной и широкое поле платформ. Коммерческие системы SIM уже доступны сегодня с выдающимися техническими характеристиками, однако они выходят за рамки финансовых возможностей многих научно-исследовательских лабораторий, и, самое главное, они являются негибкими быть изменены и разработаны для реализации новейших разработок научных исследований в этой области. Они также не имеют существенный потенциал для &#39;быть адаптирована для эксперимента под рукой &quot;, часто критически узкое место в передний край жизни науки исследований. Система , описанная здесь , будет особенно хорошо подходит для изучения динамических процессов вблизи поверхности клеток, для исследования реконструированных двухслойных систем в пробирке, чтобы изучать химию поверхности в материалах и физических наук, например. 2D-материалов, а также многих других приложений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1149">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Toptica</td>
			<td style="width:181px;">iBeam SMART</td>
			<td style="width:535px;">with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Coherent</td>
			<td style="width:181px;">OBIS LS</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">640 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Cobolt</td>
			<td style="width:181px;">MLD</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Long-pass dichroic mirrors&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td>for combining excitation beams</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:143px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;">58-860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor calcite polarizers</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GT5-A</td>
			<td>For alignment of LCVR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM05PM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic half wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AHWP05M-600</td>
			<td>400 - 800 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>For HWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Liquid Crystal Variable Retarder</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">SWIFT</td>
			<td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">LCVR controller</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">D3060HV</td>
			<td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic quarter wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">AQM-100-0545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1P/M</td>
			<td>For QWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">10 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC080-010-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">200 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Cage XY Translators</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Ferroelectric spatial light modulator</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-00249&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">SLM mounting frame</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-10014</td>
			<td>Fixed to custom built aluminium mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">&#216;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GM200/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">XYR1/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rail carrier</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">M-PRC-3</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision Optical Rail</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">PRL-6</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 273 322&#160;</td>
			<td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">140 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 239 322</td>
			<td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision XY Translation Mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">LM2XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Lens Mounting Adapters</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM2AD32</td>
			<td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&#34; mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Translation stages</td>
			<td style="width:143px;">Comar</td>
			<td style="width:181px;">12XT65</td>
			<td>Dovetail, side drive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">XY Translator with Differential Drives</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">ST1XY-D/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC508-300-A-ML</td>
			<td>Excitation tube lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Automated XY stage with Z-piezo top plate</td>
			<td style="width:143px;">ASI</td>
			<td style="width:181px;">PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&#160;</td>
			<td>with MS-2000 controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Inverted microscope frame</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Objective lens</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">UAPON100XOTIRF</td>
			<td>100X/1.49NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">High speed filter wheel</td>
			<td style="width:143px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:181px;">HF110A</td>
			<td>with Prior ProScan III controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bandpass emission filters</td>
			<td style="width:143px;">Semrock</td>
			<td style="width:181px;">FF01-525/30, FF01-676/29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:143px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:181px;">ORCA Flash v4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stage top incubator</td>
			<td style="width:143px;">OKO Lab</td>
			<td style="width:181px;">H301-K-FRAME</td>
			<td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stainless steel optical posts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">TR series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Post holders</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">PH series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Kinematic mirror mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">KM100</td>
			<td>for mounting 1&#34; mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">100 nm fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">T-7279</td>
			<td>Tetraspeck</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">83697-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">8 well glass bottom dishes</td>
			<td style="width:143px;">ibidi</td>
			<td style="width:181px;">80827</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">155409</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">0.01mm microscope reticle slide</td>
			<td style="width:143px;">EMS</td>
			<td style="width:181px;">68039-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C10613</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

Оптический супер-разрешением изображения с структурирован освещения микроскопии (SIM) является ключевой технологией для визуализации процессов на молекулярном уровне в химической и медико-биологических наук. Хотя коммерческие системы SIM доступны, системы, которые специально созданных в лаборатории может превзойти коммерческие системы, последний, как правило, предназначены для простоты использования и применения общего назначения, как с точки зрения верности изображения и скорости. В данной статье представлен детальный путеводитель по созданию системы, которая использует SIM полного внутреннего отражения (TIR) ​​освещения и способна визуализации с частотой до 10 Гц в трех цветах при разрешении достигает 100 нм. Благодаря сочетанию SIM и TIRF, система обеспечивает лучшую контрастность изображения, чем конкурирующие технологии. Для достижения этих спецификаций, несколько оптических элементов используются для автоматизированного контроля за состоянием поляризации и пространственной структуры освещающего света для всех доступных WAV возбужденияelengths. Полная информация о аппаратной реализации и контроля приведены для достижения синхронизации между генерации возбуждающего света картины, длины волны, состояния поляризации и управления камерой с акцентом на достижение максимальной частоты кадров приобретения. Протокол шаг за шагом для выравнивания системы и калибровки представлена ​​и улучшение достижимое разрешение проверяется на идеальных образцах. Возможность для видео-курса супер-разрешением изображения демонстрируется с живыми клетками.

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors at JoVE.com

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Руководство по Structured Illumination TIRF микроскопией на высокой скорости с несколькими цветами

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-чип томографический микроскопии Используя Multi-угол освещения и Pixel супер-разрешение

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

От вокселей к знаниям: Практическое руководство по сегментации комплекс электронной микроскопии 3D-данных

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Высокоскоростной югу ГГц спектрометр для анализа рассеяния Бриллюэна

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Метаболические поддержке подакцизным, живые ткани мозга во время приобретения микроскопии магнитного резонанса

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Количественного определения микроорганизмов при низких концентрациях, с использованием голографической цифровой микроскопии (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Внедрение микроскопии отражения помех для без этикетки, высокоскоростной визуализации микротрубок

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...