Name: coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00
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We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.

1. कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग नोट: लेबल ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ 9 microglia। वैकल्पिक रूप से, सेल लाइनों 14 में वर्णित है कि अनिवार्यता से ऐसे GFP / आरएफपी के रूप ?...

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	<li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+tumors.">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li><li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+astrocytic+glioma:+genetics,+biology,+and+paths+to+treatment.">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li><li>Li, W., Graeber, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+(CSF-1R)+signaling.">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li><li>Miller, I. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo.">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. 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J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression.">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li></ol>

उच्च ग्रेड astrocytomas और glioblastoma के अत्यधिक आक्रामक प्रकृति इन मस्तिष्क के कैंसर बहुत घातक हैं। सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण इसलिए यह ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण की आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने की है। ज्यादातर ग्लि...

ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी निदान 1,2 के समय से लगभग 12 महीने के एक औसत अस्तित्व के साथ एक आक्रामक मानव मस्तिष्क कैंसर है। ग्लयोब्लास्टोमा सबसे घातक और नैदानिक ​​चुनौतीपूर्ण कैंसर में से एक यह मानक रसायन चिकित्सा और शल्य लकीर को आग रोक के रूप में है। ग्लियोब्लास्टोमा के फैलाना प्रकृति ट्यूमर कोशिकाओं को उन्नत ट्यूमर व्यावहारिक रूप से शल्य चिकित्सा पूरी तरह से बांटना असंभव बना सामान्य मस्तिष्क भर में प्रसार करने के लिए सक्षम बनाता है। यह बेहद आक्रामक पहलू ग्लियोब्लास्टोमा और अन्य उन्नत astrocytomas की एक बानगी सुविधा है। इसलिए, अधिक से अधिक शोध का ध्यान केंद्रित ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की आणविक तंत्र पर किया गया है। ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर microenvironment द्रोह 3-6 स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण 7.8 बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार होने के लिए दिखाया गया है। इन अध्ययनों से ज्यादातर लेकिन का उपयोग कर मैक्रोफेज / microglia के प्रभाव को मापाassays जो शारीरिक रूप से उन्हें glioblastoma कोशिकाओं से अलग। हमारी प्रयोगशाला बाहर स्थापित किया है सुधार assays जो हमें अध्ययन कैसे ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पर cocultures में मैक्रोफेज / microglia निर्भर है और आक्रमण के दौरान उन दोनों के बीच शारीरिक संपर्क की छवि के लिए हमें सक्षम करने की अनुमति उत्पन्न करते हैं। क्लासिक assays को मापने के लिए सेल आक्रमण &#39;मानक&#39; Boyden कक्ष chemotaxis और chemoinvasion प्रारूपों में शामिल हैं। यहाँ कोशिकाओं का अध्ययन किया जा करने के लिए एक प्लास्टिक चैम्बर जो नीचे है कि एक निर्दिष्ट आकार (व्यास में 0.4 और 8 के बीच आम तौर माइक्रोन) के के छिद्रों पर एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर होता है में चढ़ाया जाता है। सेल आक्रमण करने की प्रक्रिया एक शारीरिक बाधा है, आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से बना शामिल है। chemoinvasion परख में, वरीय इस्तेमाल किया मैट्रिक्स Matrigel (इसके बाद के रूप में &quot;मैट्रिक्स&quot; कहा जाता है), एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन मिश्रण Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) द्वारा स्रावित माउस सार्कोमा कोशिकाओं और कर्नल के बड़े पैमाने पर होते हैंlagen प्रकार चतुर्थ और laminin। कक्षों तो एक अच्छी तरह से टिशू कल्चर के साथ जो या वृद्धि कारक है कि आक्रमण को प्रोत्साहित करने के संदेह कर रहे हैं बिना सेल संस्कृति मीडिया में शामिल है में रखा जाता है। कोशिकाओं जो एक उच्च आक्रामक क्षमता एक उच्च आवृत्ति पर बाह्य मैट्रिक्स लेपित फिल्टर के माध्यम से आक्रमण और फिल्टर के नीचे का पालन करना होगा है। हम आदेश ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण पर microglia और ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज की भूमिका का आकलन करने के लिए इस परख संशोधित किया है। 10 गुना 9,10 - हम इस कागज कि microglia द्वारा 5 दो ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों के आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते भीतर वर्णित coculture assays का उपयोग निर्धारित करने के लिए सक्षम किया गया है। यह दर्शाता है जो ग्लियोब्लास्टोमा के पशु मॉडल में मनाया जाता है। इसके अलावा, हम एक तीन आयामी आक्रमण परख जहां glioblastoma कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच बातचीत / microglia अधिक सीधे जांच की जा सकती विकसित की है। ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की हद macropha से प्रेरितGES / 3D परख में microglia क्या मैट्रिक्स लेपित चैम्बर दृष्टिकोण का उपयोग कर देखा जाता है के बराबर है। इसी assays के पहले आक्रमण 11-13 दौरान मैक्रोफेज के साथ स्तन कार्सिनोमा बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए। दोनों ही तरीकों से इस पत्र में वर्णित glioblastoma कोशिकाओं के बृहतभक्षककोशिका / microglia उत्तेजित आक्रमण की आणविक तंत्र (s) काटना करने की क्षमता में सहायता करनी चाहिए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning/Fisher Scientific</td>
			<td>Cat: 354481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12065-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL261 cell line</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 cell line</td>
			<td>American Tissue Type Culture Collection</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>American Tissue Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 &#181;M pore) 48 per pack.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat: 10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion

ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (ग्रेड चतुर्थ glioma) 1 साल के बाद निदान के एक औसत अस्तित्व के साथ एक बहुत आक्रामक मानव कैंसर है। आणविक घटनाओं है कि glioblastomas को जन्म दे की वृद्धि की समझ के बावजूद, इस कैंसर अभी भी अत्यधिक पारंपरिक इलाज करने के लिए आग रोक बनी हुई है। उच्च ग्रेड ब्रेन ट्यूमर की शल्य लकीर glioblastoma कोशिकाओं की अत्यधिक infiltrative प्रकृति के कारण शायद ही कभी पूरा हो गया है। चिकित्सकीय दृष्टिकोण जो ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण attenuate इसलिए एक आकर्षक विकल्प है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों है कि ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज और microglia (निवासी मस्तिष्क मैक्रोफेज) दृढ़ता ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रोत्साहित दिखाया है। प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित ग्लियोब्लास्टोमा-बृहतभक्षककोशिका / microglia बातचीत में इन विट्रो संस्कृति assays का उपयोग करने के लिए मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है। यह दृष्टिकोण बहुत विकास और / या दवाओं है कि मैक्रोफेज के साथ संचार को बाधित की खोज की है कि इस घातक बिहेव सक्षम बनाता सुविधा कर सकते हैंआईओआर। 10 गुना - हम दो मजबूत coculture आक्रमण assays जहां microglia / मैक्रोफेज द्वारा 5 glioma सेल आक्रमण को प्रोत्साहित स्थापना की है। ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट मार्कर या अनिवार्यता से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त के साथ लेबल मैट्रिक्स लेपित पॉली कार्बोनेट चैम्बर सम्मिलित करता है पर बिना और साथ मैक्रोफेज / microglia चढ़ाया या एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं। सेल आक्रमण फिल्टर के नीचे पर छवि के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग और केवल आक्रामक कोशिकाओं की गिनती द्वारा मूल्यांकन किया है। इन assays का प्रयोग, कई औषधीय inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, और Semapimod), पहचान की गई है जो बृहतभक्षककोशिका ब्लॉक / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रेरित किया।

यहाँ उल्लिखित तरीकों का उपयोग करना, हम पता चला है कि microglia और मैक्रोफेज काफी ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते हैं। दो अलग अलग आक्रमण assays कार्यरत हैं और चित्रा 1 में चि?...

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Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The overall goal of this experiment is to model the interaction of glioblastoma cells with microglia and macrophages during invasion in an in vitro assay. So this method can help answer key questions in the tumor microenvironment field, such as which compounds or treatments can interfere with cancer interaction with macrophages, a cell type of the microenvironment during the progression to malignancy. One of the main advantages of this technique is that it's relatively easy to perform and can be completed at a reasonable time and seems to accurately model glioblastoma invasion in vivo.Begin by differentiating the cell line of interest using phorbol myristate acetate, as follows. First, plate two to three times 10 to the fifth THP-1 cells in 1.5 milliliters of medium in a six well culture plate. Immediately after plating, add 100 nanomolar of PMA and incubate at 37 degrees Celsius and 5%CO2 for 48 hours.After 48 hours, remove the PMA by aspirating the media, wash once with one-X PBS and add fresh media. Incubate for another 48 hours until cells are ready to use in the assay. Then equilibrate matrix pre-coated chambers by placing them in a well containing 500 microliters of media without serum and then adding 500 microliters of serum free media to the top.Incubate the chambers for two hours at 37 degrees Celsius and 5%CO2. Next, gently aspirate the media from the culture vessels containing the fluorescently-labeled glioblastoma cell lines and the microglia and macrophages. Then add 500 microliters of two millimolar EDTA and PBS and incubate for five to 10 minutes in the tissue culture incubator.Collect the cells in five milliliters of media containing 0.3%bovine serum albumin and centrifuge for five minutes at 120 times G.Following the centrifugation, aspirate the supernatant and resuspend the cell pellet in appropriate media to a concentration of one times 10 to the sixth cells per milliliter. Use the hemocytometer to count the cells. Next, add 500 microliters of the appropriate media containing 0.3%BSA to the wells of a 24 well plate.Then remove the media from the equilibrated chambers and place the chambers in the wells of the 24 well plate. If inhibitors are being used to study their effect on macrophage or microglia stimulated glioma invasion, add the appropriate concentration to both the bottom and top portions of the chamber. Depending on the cell line used, mix glioblastoma cells and mouse microglia or glioma cells, and macrophage cells according to the details in the written portion of the protocol.Add the cell mixture to the top chamber and incubate for 24 to 48 hours, depending on cell type. After the incubation, remove the cells from the top of the chamber by gentle aspiration. Then place the chambers in 3.7%formaldehyde in PBS to fix.Allow the chambers to remain in fixative for 15 minutes at room temperature. Finally, remove the fixative by gentle aspiration and replace with 500 microliters of one-X PBS. First, thaw the matrix mix at four degrees Celsius overnight.Next, prepare a 10 milligrams per milliliter concentration of matrix in the appropriate media on ice. Then, harvest the labeled cells for suspension in matrix as previously shown. Then pipette 1.5 times 10 to the fifth GL261 cells in a 150 microliter volume plus five times 10 to the fourth microglia cells in 50 microliters into a 1.5 milliliter microfuge tube.Add two times 10 to the fifth GL261 cells in a 200 microliter volume into a separate 1.5 milliliter microfuge tube. Spin the cells in a microfuge for five minutes at 120 times G.Then, resuspend the cells in 200 microliters of cold matrix on ice. For this step it is crucial to have ice tray ready in the hood, keep tubes on ice, tips in the refrigerator, make sure everything is chilled in order to prevent polymerization of the mature gel prematurely.After resuspension, plate 50, 000 cells in a 50 microliter volume onto the center of the top compartment of an eight micron pore size chamber insert. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 30 minutes to allow polymerization to occur. After 30 minutes, add 200 microliters of serum free medium to the upper chamber and 700 microliters of serum containing cell growth medium to the lower well.After incubating for 48 hours, remove the cells from the top part of the chamber by gentle aspiration. Fix the chambers as before and replace the fixative with 500 microliters of one-X PBS before imaging the cells. This representative image shows invading mCherry expressing GL261 cells in the absence of microglia.The cells were plated on matrix coated chambers and incubated for 48 hours. The images were taken using a 10X objective and the scale bar represents 400 microns. Here the GL261 cells were combined with microglia.The number of GL261 invasive cells that cross the filter were quantified. As seen here, coculturing the mouse glioblastoma cell line GL261 with microglia enhances its invasion by up to 10 fold in the 2D assay. This image shows the effect of pharmacological inhibitors on microglia stimulated GL261 invasion compared to DMSO control.Data shown are from six independent experiments. This assay was successfully employed using human cell lines as well. U87 cells plated on matrix coated chambers and stained with CMFDA green are shown after a 24 hour incubation.Here the U87 cells were plated with differentiated THP1 macrophages. This image shows quantitation of the assay counting only invasive U87 cells. The human macrophage cell line THP1 stimulated U87 glioblastoma cell invasion.Data shown are the mean values from 10 independent experiments. This image from a 3D invasion assay of GL261 and microglia coculture is a composite from a Z-series of images and shows GL261 cells stained with CMFDA green embedded in matrix alone. Here the GL261 cells were cocultured with murine microglia labeled with CMPTX red.Here GL261 cells on the underside of the filter, which are determined to be invasive, are shown. The total number of invading GL261 cells was determined and normalized to that of GL261 cells in monoculture. Data shown represent the mean of three independent experiments performed in duplicate.So once mastered, this technique can be completed from start to finish in two hours or so. And the final results from the experiment can be obtained after 48 hours. So while performing this technique, it's very important to have everything chilled and at four degrees including the tubes and the pipettes.After watching this video, you should have a good understanding of how to establish glioblastoma in macrophage microglia coculture invasion assays.

Research

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