Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

نشكر POLAN سانتوس ودارين Obbard عن الرسوم التوضيحية ذبابة الفاكهة في الشكل. 2A، مارسيلو جاكوبس-لورينا لاستخدام insectary JHMRI. وأيد هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (فرقة العمل الرفيعة المستوى)، لجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة)، والمعاهد الوطنية للصحة منح NS096677، NS037402 وNS083373 (JMH). هو لام تانغ هو زميل مؤسسة Shurl وكاي كورتشي من مؤسسة أبحاث علوم الحياة.

1. إعداد الذباب CaspaseTracker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد CaspaseTracker (DQVD) يطير للتجارب، تنفيذ هذا الصليب: يو بي آي-CaspaseTracker ز س-TRACE (UAS-طلب تقديم العروض، UAS-FLP، يو بي آي&gt; وقف&gt; GFP-NLS)، عن طريق نقل 7-10 إناث البكر (أو الذكور) الذباب يحمل كاسباس جهاز ...

نحن هنا توضيح البناء والداخلية عمل من CaspaseTracker التي تسهل الكشف عن النشاط كاسباس القاعدية على نطاق واسع في الأنسجة السليمة. الخطوات الحاسمة للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك في الجسم الحي هي: 1) توليد الذباب مع التحوير جهاز الاستشعار البيولوجي، 2) التحقق من وظيفة م?...

Caspases هي البروتياز السيستين التي تتوسط موت الخلايا أفكارك التي كتبها الشق العديد من البروتينات داخل الخلايا بعد مخلفات اسبارتاتي الرئيسية. على سبيل المثال، caspases البادئ تفعيل caspases المستجيب، nucleases الحمض النووي derepress، مكونات هيكل الخلية يلتصق وتغير تكوين الدهون أغشية الخلايا لتفكيك بسرعة الخلايا وتحفيز الاعتراف بها والغمر من الخلايا التي تتخلص من الجثث الخلية المجاورة. 1-4 ويقدر أن المليارات من الخلايا تموت يوميا في جسم الإنسان، وموت الخلايا المبرمج هو آلية هامة من موت الخلايا السرطانية الناجمة عن العلاج الكيميائي. 5 مجموعة مختلفة من caspases يمكن أن يسبب موت الخلايا عن طريق العمليات غير أفكارك واضحة لتنشيط المناعة الفطرية. 6 لذلك، وقد ركزت معظم البحوث حول caspases على وظائف الموالية للموتهم. ومن المثير للاهتمام، كشفت أدلة في وقت مبكر في الحقل الذي نفس caspases المسؤولة عن تعزيز موت الخلايا أيضا غير الموت وunctions. وقد أثبتت الدراسات الرائدة التي caspases يشاركون في الوظائف الخلوية المتنوعة في الخلايا السليمة، بما في ذلك تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة خلال مرحلة التطور الجنيني. مطلوبة 7-9 Caspases لتفريد النطف في ذبابة الفاكهة 10،11، من أجل الحيلولة دون وnecroptotic مسار موت الخلايا البديل في الفئران 12،13، وتجهيز الرنا الميكروي في C. ايليجانس. 14،15 في ربما تورط الأطول عمرا الخلايا، الخلايا العصبية، caspases والآلات أفكارك أخرى في تنظيم نشاط الخلايا العصبية عن طريق تقليم النهايات متشابك، وهي عملية يعتقد أنه ضروري لتعزيز نقاط الاشتباك العصبي الأخرى للتعلم والذاكرة. 16- 18 فمن الممكن أن caspases تسهل التقليم متشابك من نوع مصغرة موت الخلايا المبرمج للتوقعات العصبية صغيرة دون موت الخلايا كله. 19 ومع ذلك، caspases قد يكون لها وظائف بديلة لا علاقة لها بأحداث مثل موت الخلايا المبرمج. 20،21 الدور المزدوجفي الحياة والموت ليست فريدة من نوعها لcaspases. بي سي إل-2 البروتينات الأسرة والسيتوكروم ج لها أدوار في قطاع الطاقة الخلوية في الخلايا السليمة ولكن هي أيضا جزء من مسار أفكارك الأساسية التي يتم تفعيلها من خلال أنواع كثيرة من الإجهاد خلية 22-25 على الرغم من أن لم يثبت، فإنه يبدو من المنطقي أن تطور ربطت اليوم -jobs إلى الموت فرصة عمل خلال نفس الجزيئات لضمان القضاء في الوقت المناسب من الخلايا غير صالحة أو غير مرغوب فيها. في الوقت الحاضر، ليست مفهومة الآليات الجزيئية النشاط كاسباس غير أفكارك، وأيضا لا يعرف مدى النشاط كاسباس غير أفكارك أثناء التطور الجنيني وفي أنسجة البالغين. ويتمثل التحدي الرئيسي هو صعوبة في التمييز أيام عمل من الموت ظائف caspases. وعلى النقيض من الخلايا وpyroptosis، عندما يتم تضخيمه النشاط كاسباس التي كتبها شلال بروتين، ومن المتوقع أن تحدث على مستويات أدنى من النشاط الأنزيمي، على الأرجح دون الكشف عن العديد من ميتاليك يتوفر-وظائف اليوم من caspasesاذكر. قبل العمل المقدم هنا، وضعت غيرها من مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار كاسباس لأغراض مختلفة. وأجهزة الاستشعار SCAT (على سبيل المثال، ECFP-DEVD-الزهرة) كشف بسرعة في الوقت الحقيقي النشاط كاسباس في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية باستخدام الحنق. 26،27 وبعد انشقاق كاسباس، شاردة GFP المستهدفة النووية من Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) يخضع لإعادة المركزية التحت خلوية في غضون دقائق عند المشقوق في البلازما غشاء حبل من caspases. 28 وبالمثل، ApoAlert-pCaspase3 الاستشعار (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes من العصارة الخلوية إلى النواة على الانقسام كاسباس. 29،30 أكثر في الآونة الأخيرة، وحامل اللون في iCasper تم هندستها بذكاء ليتألق عندما المشقوق من قبل caspases، والسماح الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في الوقت الحقيقي في الخلايا العصبية للأجنة ذبابة الفاكهة، ولكن في المقام الأول بالتعاون مع موت الخلايا التنموي. فاة 31 كاسباس التي تعتمد على الخلايا العصبية الشمية خلال الشيخوخة كان demonstقام بتقييمه المناعية الكشف عن شكل المشقوق كاسباس من أجهزة الاستشعار CPV (على سبيل المثال، mCD8-PARP فينوس). 32،33 الأهم من ذلك، تم الكشف عن شكل تفعيلها من كاسباس 3 في غياب موت الخلايا التي immunostain حساس في العمود الفقري لل الخلايا العصبية مثقف، وفي سوما باستخدام مضان تعتمد كاسباس من الصبغة مراسل CellEvent النووي، ولكن واجه صعوبات بسبب الصور سمية، على الرغم من موت الخلايا تأخر حتى بعد إزالة العمود الفقري. 19 وهكذا، هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار كاسباس جديدة للكشف عن وتعقب الخلايا مع النشاط كاسباس القاعدية في الجسم الحي. للتغلب على هذه الصعوبات، ولدت لنا رواية المزدوج جهاز الاستشعار البيولوجي اللون كاسباس، المعين CaspaseTracker. هذه الاستراتيجية يجمع بين نسخة معدلة من ذبابة الفاكهة كاسباس الحساسة Apoliner جهاز الاستشعار البيولوجي 28 مع ذبابة الفاكهة G-TRACE نظام FRT recombinase 34 لتسمية بشكل دائم وتعقب الخلايا في الجسم الحي. &lt;سوب&gt; 35 نظام G-TRACE تنشيط GAL4-يسمح مستويات منخفضة جدا من caspases لتفعيل CaspaseTracker، مما أدى إلى التعبير طلب تقديم العروض في السيتوبلازم والتعبير GFP المستهدفة النووي دائم في أي خلية التي شهدت من أي وقت مضى النشاط كاسباس 35 يمكن هذا النظام تسمية الخلايا في جميع أنحاء الحياة في الحيوانات كلها باستخدام ذبابة الفاكهة، نظام نموذجي لين العريكة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة caspases وموت الخلايا. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

هناك نوعان من العناصر الرئيسية التي تسمح CaspaseTracker للكشف عن النشاط كاسباس في الخلايا السليمة العادية (الشكل 1A). وأول هذه هو 146 حمض أميني كاسباس شطورة ببتيد على غرار كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي Apoliner (الشكل 1B). 28 ويستمد هذا بب?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

للكشف عن الخلايا السليمة في الحيوانات كلها التي تحتوي على مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، تم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي حساسة للغاية المعينة CaspaseTracker لذبابة الفاكهة. تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي التي تعتمد على كاسباس في الخلايا السليمة عاش فترة طويلة في جميع أنحاء الأعضاء الداخلية للحيوانات الكبار تربى في ظل ظروف الأمثل في ظل غياب المحفزات الموت.

في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

في الوقت الحقيقي في فيفو تسجيل إشارات الكالسيوم أعطيت خلال تغذية الحشرة باستخدام بيوسينسور نيون

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...