Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

Vi takker Polan Santos og Darren Obbard for Drosophila illustrationer i fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena for brug af JHMRI insektbetingelser. Dette arbejde blev støttet af Life Science Research Foundation fællesskab (HLT), University Grants udvalg af Hong Kong AOE / B-07/99 (MCF), og NIH giver NS096677, NS037402 og NS083373 (JMH). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation.

1. Fremstilling af CaspaseTracker Flies <ol><li> For at forberede CaspaseTracker (DQVD) flyver til forsøg, udføre denne indlæg: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi&gt; Stop&gt; GFP-NLS), ved at overføre 7-10 jomfru kvindelige (eller mand) fluer bærer caspase biosensor substrat mCD8-DIAP1-Gal4 drevet af ubiquitinpromotoren 35 sammen med det samme antal mænd (eller kvinde) G-TRACE fluer, som har den anden kromosom cyo balancer at undgå letalitet den homozygote kombinat...

Her viser vi bygge- og indre funktioner i CaspaseTracker der letter påvisning af udbredt basal caspase aktivitet hos raske væv. De kritiske trin til påvisning ikke-apoptotisk caspase aktivitet in vivo er: 1) at generere fluer med biosensoren transgen, 2) at kontrollere caspase-specifikke reporter funktion med passende kontroller, 3) øve dissektion teknikker til at overholde alle interne organsystemer af voksne Drosophila, og 4) skelne biosensor aktivitet fra autofluorescerende artefakter. <p cl...

Caspaser er cysteinproteaser, som medierer apoptotisk celledød ved spaltning mange intracellulære proteiner efter centrale aspartatrester. For eksempel, initiator-caspaser aktivere effektor-caspaser, derepressere DNA nukleaser, spalter cytoskeletale komponenter, og ændre lipidsammensætning af cellemembraner til hurtigt demontere celler og stimulere deres anerkendelse og engulfment ved naboceller, som bortskaffer cellen lig. 1-4 Det anslås at milliarder af celler dø per dag i det menneskelige legeme, og apoptose er en vigtig mekanisme af kemoterapi-induceret tumor celledød. 5 et andet sæt af caspaser kan forårsage celledød ved distinkte ikke-apoptotiske processer til at stimulere medfødte immunitet. 6 Derfor, mest forskning i caspaser har fokuseret på deres pro-død funktioner. Interessant første undersøgelsesresultater på området afslørede, at de samme caspaser ansvarlige for at fremme celledød har også ikke-død funktioner. Banebrydende undersøgelser har vist, at caspaser er involveret i forskellige cellulære funktioner i raske celler, herunder reguleringen af celledeling og migrering under embryogenese. 7-9 Caspaser er nødvendige for sædcelleantal individualisering i Drosophila 10,11, for at blokere en alternativ necroptotic celledød vej i mus 12,13, og for microRNA forarbejdning i C. elegans. 14,15 I måske de længste levede celler, neuroner, caspaser og andre apoptotisk maskiner er impliceret i reguleringen af neuronal aktivitet ved beskæring synaptiske slutninger, en proces menes være vigtigt at styrke andre synapser for indlæring og hukommelse. 16- 18. Det er muligt, at caspaser lette synaptisk beskæring af en type mini-apoptose af bittesmå neuronale projektioner uden hele celledød. 19 imidlertid caspaser kan have alternative funktioner ikke er relateret til apoptose-lignende begivenheder. 20,21 dobbeltrolles i liv og død er ikke enestående for caspaser; BCL-2 familie proteiner og cytochrom c har roller i cellulære energetik i sunde celler, men er også en del af kernen apoptosecyklus, der aktiveres af mange typer af celle stress. 22-25 Selvom det ikke er bevist, synes det logisk, at evolutionen har kædet dag -jobs til døden-jobs inden for de samme molekyler at sikre rettidig eliminering af uegnede eller uønskede celler. På nuværende tidspunkt er de molekylære mekanismer i ikke-apoptotisk caspaseaktivitet ikke forstået, og omfanget af ikke-apoptotisk caspaseaktivitet under embryonisk udvikling og i voksent væv vides heller ikke. En stor udfordring er vanskeligheden ved at skelne dag-job fra død-job af caspaser. I modsætning til apoptose og pyroptosis, når caspase aktivitet forstærkes af et proteolytisk kaskade, der forventes at forekomme ved meget lavere niveauer af enzymatisk aktivitet, sandsynligvis under påvisning af mange tilgængelige techn dag-job caspaserologies. Før arbejdet præsenteret her, andre har udviklet en række caspase biosensorer til forskellige formål. De SCAT biosensorer (f.eks ECFP-DEVD-Venus) hurtigt opdage realtid caspase aktivitet i dyrkede celler og animalske væv ved hjælp FRET. 26,27 Ved caspase spaltning, den nukleare målrettet GFP-delen af Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) undergår subcellulær relocalization inden for minutter, når dens plasmamembran-tether spaltes af caspaser. 28 Tilsvarende ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes fra cytosolen til cellekernen ved caspase-spaltning. 29,30 Mere for nylig blev kromoforen i iCasper ødelagde manipuleret til at fluorescere ved spaltning ved caspaser, hvilket tillader påvisning af biosensor aktivitet i realtid i neuroner i Drosophila embryoner, men primært i forbindelse med udviklingstoksicitet celledød. 31 Caspase-afhængig død olfaktoriske neuroner under lagringen var demonstbedømt af immuno-påvisning af caspase-spaltet form af CPV biosensorer (f.eks mCD8-PARP-Venus). 32,33 vigtigt, blev den aktiverede form af caspase-3 påvises i fravær af celledød ved følsomme immunofarvningsprocedure i ryggen på dyrkede neuroner, og i soma hjælp af caspase-afhængig fluorescens af nukleare CellEvent reporter-farvestof, men vanskeligheder har man mødt på grund af foto-toksicitet, selvom celledød blev forsinket til efter rygsøjlen elimination. 19 er således behov for nye caspase biosensorer til påvisning og spore celler med basal caspase-aktivitet in vivo. For at overvinde disse vanskeligheder, genereret vi en ny dual farve caspase biosensor, betegnet CaspaseTracker. Denne strategi kombinerer en modificeret version af Drosophila caspase-følsomme Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinasesystem 34 permanent mærke og spore celler in vivo. &lt;sup&gt; 35 Gal4-aktiverede G-TRACE system tillader meget lave niveauer af caspaser at aktivere CaspaseTracker, hvilket resulterer i RFP udtryk i cytoplasmaet og permanent nuklear målrettet GFP-ekspression i en celle, der nogensinde har oplevet caspase aktivitet. 35 Dette system kan mærke celler hele livet i hele dyr ved hjælp Drosophila melanogaster, en tractable og udbredte modelsystem til undersøgelse af caspaser og celledød. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Der er to vigtige komponenter, der tillader CaspaseTracker at detektere caspaseaktivitet i normale sunde celler (figur 1A). Den første af disse er en 146 aminosyre caspase-spaltelig polypeptid modelleret efter caspase biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Dette polypeptid er afledt af DIAP1 (Drosophila inhibitor af apoptose) indeholdende en enkelt naturligt forekommende caspase site, der spaltes under apoptose typisk af caspase DrICE. <s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

For at detektere sunde celler i hele dyr, der indeholder lave niveauer af caspaseaktivitet, blev den meget følsomme biosensor betegnet CaspaseTracker genereret for Drosophila. Caspase-afhængige biosensor aktivitet detekteres i langlivede raske celler i hele de indre organer af voksne dyr, der er opdrættet under optimerede betingelser i fravær af død stimuli.

In vivo Biosensor Tracks Ikke-apoptotisk Caspase aktivitet i Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking tilgang til Isoler proteinkomplekser Fra Drosophila Embryoner

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionel Opløsning og kanalaktivitet Målinger af renset Vildtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling af Larve aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetsovervågning

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo optagelse af Arabidopsis calciumsignaler under insekt fodring ved hjælp af en fluorescerende Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...