Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

אנו מודים Polan סנטוס דארן Obbard לאיורים תסיסנית באיור. 2a, מרסלו ג&#39;ייקובס-לורנה לשימוש של insectary JHMRI. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת קרן המחקר מדעי החיים (HLT), ועדת המענקים אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF), ו- NIH מעניקה NS096677, NS037402 ו NS083373 (JMH). הו לם טאנג הוא עמית קרן Shurl וקיי קורצ&#39;י של קרן המחקר למדעי החיים.

1. הכנת זבובים CaspaseTracker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין CaspaseTracker (DQVD) זבובים לניסויים, לבצע הצלב הזה: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (כטב&quot;מ-RFP; כטב&quot;מ-FLP; Ubi&gt;&gt; עצירה GFP-NLS), על ידי העברת נקבה בתולה 7-10 (או זכר) זבובים נושאת את המצע biosensor caspase mCD8-DIAP1-Gal4 מ...

כאן אנו מדגימים את פעולתו הבנייה הפנימית של CaspaseTracker המאפשר זיהוי של פעילות caspase בסיס נרחבת ברקמות בריאות. השלבים הקריטיים לאיתור פעילות caspase הלא אפופטוטיים in vivo הם: 1) יצירת זבובים עם transgene biosensor, 2) אימות פונקצית כתב ספציפי caspase עם בקרה נאותה, 3) תרגול טכניקות לנתיחה ...

Caspases הם פרוטאזות ציסטאין אשר מתווכים מוות של תאים אפופטוטיים ידי ביקוע חלבונים תאיים רבים אחרי שאריות aspartate מפתח. לדוגמה, caspases יוזם להפעיל caspases מפעיל, nucleases DNA derepress, רכיבים cytoskeletal תדבק ולשנות את הרכב השומנים של קרום התא לפרק תאי במהירות לעורר הכרה היבלעות על ידי תאים שכנים אשר לסלק את הגוויות התא. 1-4 ההערכה היא כי מיליארדי תאים מתים ליום בגוף האדם, אפופטוזיס הוא מנגנון חשוב של מוות של תאים סרטניים הנגרמת כימותרפיה. 5 סט של caspases שונה יכול לגרום מוות של תאים על ידי תהליכים שאינם אפופטוטיים ברורים כדי לעורר חסינות מולדת. 6 לפיכך, עיקר מחקר על caspases התמקד פונקציות פרו-מותם. מעניין לציין, כי עדויות ראשוניות בתחום גילו כי באותה caspases האחראי למותו תא קידום יש גם f שאינו מוותמשיחה. המחקרים החלוציים הוכיחו כי caspases מעורבים תפקודים תאיים מגוונים בתאים בריאים, ובכלל זה הסדרת תא התפשטות והגירה במהלך embryogenesis. 7-9 caspases נדרשים עבור אינדיבידואליזציה spermatid תסיסנית 10,11, עבור חסימת מסלול מוות של תאים necroptotic חלופי בעכברים 12,13, ו לעיבוד microRNA ב C. elegans. 14,15 בשנת אולי התאים-מי שמאריך ימים ביותר, נוירונים, caspases ומכונות אפופטוטיים אחרים מעורבים בוויסות הפעילות העצבית על ידי גיזום סופים הסינפטי, תהליך האמין להיות חיוני כדי לחזק סינפסות אחרות על למידה וזיכרון. 16 18 יתכן כי caspases להקל גיזום סינפטי על ידי סוג של מיני-אפופטוזיס של תחזיות עצביות זעירות ללא מות תא כולו. 19 עם זאת, caspases יכול להיות פונקציות חלופיות שאינן קשורות לאירועים כמו אפופטוזיס. 20,21 תפקיד כפולs בחיים ומוות אינם ייחודיים caspases; BCL-2 חלבונים המשפחה ציטוכרום C יש תפקידים אנרגטיקה הסלולר בתאים בריאים אבל הם גם חלק של מסלול אפופטוטיים הליבה כי הוא מופעל על ידי סוגים רבים של מתח התא. 22-25 אמנם לא הוכח, זה נראה הגיוני שהאבולוציה מקושר יום -משרות אל משרות מוות בתוך אותו למולקולות כדי להבטיח חיסול בזמן של תאים מתאימים או לא רצויים. נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים של פעילות caspase הלא אפופטוטיים אינם מובנים, ואת היקף פעילות caspase הלא אפופטוטיים במהלך התפתחות עוברית ברקמות למבוגרות גם אינו ידוע. אחד האתגרים הגדולים הוא הקושי להבחין-עבודות היום ממוות-עבודות של caspases. בניגוד אפופטוזיס pyroptosis, כאשר פעילות caspase מוגברת על ידי מפל פרוטאוליטים, היום-העבודות של caspases צפויות להתרחש בשעה נמוכה בהרבה רמות של פעילות אנזימטית, סביר מתחת זיהוי על ידי techn רב הזמיןologies. לפני העבודה המוצגת כאן, ואחרים פיתחו מגוון של חיישנים ביולוגיים caspase למטרות שונות. את biosensors SCAT (למשל, ECFP-DEVD-ונוס) במהירות לזהות פעילות caspase בזמן אמת בתאים בתרבית ורקמות החיה באמצעות סריג. 26,27 עם מחשוף caspase, מחצית GFP במיקוד הגרעין של Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) עובר relocalization subcellular בתוך דקות כאשר-לקשור קרום הפלזמה שלה הוא ביקע ידי caspases. 28 בדומה לכך, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes מן cytosol לגרעין על מחשוף caspase. 29,30 נוסף לאחרונה, chromophore ב iCasper תוכנן בחוכמה כדי לזרוח כאשר בקע ידי caspases, המתיר גילוי של פעילות biosensor בזמן אמת בנוירונים של עבר תסיסנית, אבל בעיקר בשיתוף עם מוות של תאים התפתחותי. 31 מות caspase-תלוי של נוירונים חוש הריח במהלך הזדקנות הייתה demonstעל פי דירוג של איתור חיסוני של הטופס בקע-caspase של חיישנים ביולוגיים CPV (למשל, mCD8-PARP-ונוס). 32,33 חשוב לציין, בצורה המופעלת של caspase-3 זוהתה בהעדר המוות של תאים על ידי immunostain הרגיש קוצים של נוירונים בתרבית, ובשנת סומה באמצעות הקרינה תלויה caspase של צבע כתב CellEvent הגרעיני, אך קשיים נתקלו בשל צילום רעיל, למרות מות תאים התעכב עד לאחר חיסול עמוד שדרה. 19 לפיכך, חיישנים הביולוגיים caspase חדשים יש צורך לזהות ולעקוב אחר תאים עם פעילות caspase הבזליים in vivo. כדי להתגבר על קשיים אלה, שעוררנו biosensor caspase צבע כפול רומן, מיועד CaspaseTracker. אסטרטגיה זו משלבת גרסה שונה של biosensor Apoliner caspase-רגיש תסיסנית 28 עם מערכת תסיסנית G-TRACE FRT recombinase 34 לתייג לצמיתות ולעקוב אחר תאים in vivo. &lt;sup&gt; 35 המערכת G-TRACE Gal4 המופעל מאפשר רמות נמוכות מאוד של caspases להפעיל CaspaseTracker, וכתוצאה מכך ביטוי RFP בציטופלסמה וביטוי GFP גרעינית במיקוד קבוע בכל תא שאי פעם חוותה פעילות caspase. 35 מערכת זו יכולה לתייג תאים לאורך כל החיים בחיות כולו באמצעות תסיסנית, מערכת מודל ממושמע בשימוש נרחב לחקר caspases תהליכי המוות התאי. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

ישנם שני מרכיבים מרכזיים המאפשרים CaspaseTracker כדי לזהות פעילות caspase בתאים הבריאים (איור 1 א). הראשון שבהם הוא חומצת אמינו 146 פוליפפטיד caspase-cleavable במתכונת (איור 1b) caspase biosensor Apoliner. 28 פוליפפטיד זה נגזר DIAP1 (דרוזופילה מעכב אפופטוזיס...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...