Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
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हम छवि में ड्रोसोफिला चित्रों के लिए पोलन सैंटोस और डैरेन Obbard धन्यवाद। 2A, JHMRI insectary के उपयोग के लिए मार्सेलो याकूब-लोरेना। इस काम के लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फैलोशिप (HLT) द्वारा समर्थित किया गया था, विश्वविद्यालय अनुदान समिति हांगकांग AoE / बी-07/99 (एमसीएफ), और एनआईएच अनुदान NS096677, NS037402 और NS083373 (JMH)। हो लाम तांग लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन की एक Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन साथी है।

1. CaspaseTracker मक्खियों की तैयारी <ol><li> CaspaseTracker (DQVD) तैयार करने के प्रयोगों के लिए मक्खियों, इस पार प्रदर्शन: यूबीआई-CaspaseTracker एक्स जी-ट्रेस (यूएएस आरएफपी; यूएएस FLP; यूबीआई&gt; बंद करो&gt; GFP-एनएलएस), 7-10 कुंवारी महिला स्थान...

यहाँ हम CaspaseTracker के निर्माण और अंदरूनी कामकाज कि स्वस्थ ऊतकों में बड़े पैमाने पर बेसल कस्पासे गतिविधि का पता लगाने की सुविधा को दर्शाते हैं। विवो में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए महत्वप...

Caspases सिस्टीन proteases कि कुंजी aspartate अवशेषों के बाद कई intracellular प्रोटीन cleaving द्वारा apoptotic कोशिका मृत्यु मध्यस्थता कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, सर्जक caspases प्रेरक caspases, derepress डीएनए न्युक्लिअसिज़, फोड़ना cytoskeletal घटकों को सक्रिय करने और कोशिका झिल्ली के लिपिड संरचना में परिवर्तन तेजी से कोशिकाओं को नष्ट करने और पड़ोसी कोशिकाओं है कि सेल लाशों के निपटान के द्वारा अपनी पहचान और घिराव प्रोत्साहित करने के लिए। 1-4 यह अनुमान है मानव शरीर में प्रति दिन कोशिकाओं के अरबों मर जाते हैं कि, और apoptosis कीमोथेरेपी प्रेरित ट्यूमर कोशिका मृत्यु का एक महत्वपूर्ण तंत्र है। 5 caspases का एक अलग सेट इसलिए सहज प्रतिरक्षा को प्रोत्साहित करने के लिए अलग-अलग गैर apoptotic प्रक्रियाओं द्वारा कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है। 6, caspases पर सबसे अधिक शोध उनके समर्थक मौत कार्यों पर ध्यान केंद्रित किया है। दिलचस्प है, इस क्षेत्र में प्रारंभिक सबूत से पता चला एक ही caspases को बढ़ावा देने कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार भी गैर-मौत च हैunctions। अग्रणी अध्ययन दिखा दिया है कि caspases स्वस्थ कोशिकाओं में विविध सेलुलर कार्यों, embryogenesis दौरान सेल प्रसार और प्रवास के नियमन सहित में शामिल हैं। 7-9 caspases, ड्रोसोफिला 10,11 में spermatid वैयक्तिकरण के लिए आवश्यक हैं एक वैकल्पिक necroptotic कोशिका मृत्यु मार्ग अवरुद्ध करने के लिए चूहों 12,13 में, और सी में microRNA प्रसंस्करण के लिए एलिगेंस। 14,15 शायद में सबसे लंबे समय तक रहते थे कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, caspases और अन्य apoptotic मशीनरी neuronal गतिविधि के नियमन में synaptic अंत छंटाई से फंसा रहे हैं, एक प्रक्रिया माना जाता है कि सीखने और स्मृति के लिए अन्य synapses को मजबूत करने के लिए आवश्यक हो सकता है। 16- 18 यह है कि caspases पूरे कोशिका मृत्यु के बिना छोटे न्यूरोनल अनुमानों के मिनी apoptosis की एक प्रकार से synaptic छंटाई की सुविधा के लिए संभव है। 19 हालांकि, caspases apoptosis-तरह की घटनाओं के लिए असंबंधित विकल्प कार्यों हो सकता है। 20,21 दोहरी भूमिकाजीवन और मृत्यु में caspases के लिए अद्वितीय नहीं कर रहे हैं; बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन और साइटोक्रोम ग स्वस्थ कोशिकाओं में सेलुलर ऊर्जा विज्ञान में भूमिका है लेकिन यह भी कोर apoptotic मार्ग है कि सेल तनाव के कई प्रकार से सक्रिय है का हिस्सा हैं। 22-25 हालांकि साबित नहीं, यह तार्किक है कि विकास दिन से जोड़ दिया है लगती है एक ही अणुओं के भीतर मृत्यु नौकरियों के लिए अयोग्य -नौकरियां या अवांछनीय कोशिकाओं के समय पर उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए। वर्तमान में, गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि के आणविक तंत्र समझ नहीं रहे हैं, और भ्रूण के विकास के दौरान और वयस्क ऊतकों में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि की हद तक भी ज्ञात नहीं है। एक बड़ी चुनौती caspases की मृत्यु नौकरी से दिन-नौकरियों भेद करने में कठिनाई है। apoptosis और pyroptosis, जब कस्पासे गतिविधि एक प्रोटिओलिटिक झरना से परिलक्षित होता है के विपरीत, caspases के दिन के रोजगार के अवसर उपलब्ध कई techn द्वारा की संभावना का पता लगाने के नीचे enzymatic गतिविधि के कम से काफी कम स्तर, घटित होने की उम्मीद कर रहे हैंologies। यहाँ प्रस्तुत काम करने से पहले, दूसरों को विभिन्न प्रयोजनों के लिए कस्पासे biosensors की एक किस्म विकसित की है। गोबर biosensors (जैसे, ECFP-DEVD-शुक्र) तेजी से वास्तविक समय कस्पासे गतिविधि संवर्धित कोशिकाओं और जानवरों के ऊतकों में झल्लाहट का उपयोग कर कस्पासे दरार करने पर पता लगा। 26,27, Apoliner (mCD8-आरएफपी DQVD- की परमाणु-लक्षित GFP आधा भाग nucGFP) मिनट जब अपने प्लाज्मा झिल्ली-तार caspases द्वारा cleaved है के भीतर subcellular पुनर्स्थानीकरण आए। 28 इसी तरह, ApoAlert-pCaspase3 सेंसर (एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस) कस्पासे दरार पर नाभिक को cytosol से relocalizes। 29,30 अधिक हाल ही में, iCasper में क्रोमोफोर चतुराई से उम्र बढ़ने था दौरान जब caspases द्वारा cleaved, ड्रोसोफिला भ्रूण के न्यूरॉन्स में वास्तविक समय में biosensor गतिविधि का पता लगाने की अनुमति, लेकिन मुख्य रूप से विकास कोशिका मृत्यु के सहयोग से प्रतिदीप्ति करने के लिए इंजीनियर था। घ्राण न्यूरॉन्स की 31 कस्पासे निर्भर मौत demonstसीपीवी biosensors (जैसे, mCD8-PARP-शुक्र) की कस्पासे cleaved फार्म की इम्युनो-पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया गया। 32,33 महत्वपूर्ण बात है, कस्पासे 3 की सक्रिय रूप से कांटा में संवेदनशील immunostain द्वारा कोशिका मृत्यु के अभाव में पाया गया था सभ्य न्यूरॉन्स, और सोमा परमाणु CellEvent रिपोर्टर डाई की कस्पासे निर्भर प्रतिदीप्ति का उपयोग, लेकिन कठिनाइयों, फोटो विषाक्तता के कारण सामना करना पड़ा था, हालांकि कोशिका मृत्यु रीढ़ उन्मूलन के बाद जब तक देर हो रही थी में। 19 इस प्रकार, नए कस्पासे biosensors का पता लगाने की जरूरत है और इन विवो में बेसल कस्पासे गतिविधि के साथ कोशिकाओं को ट्रैक। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, हम एक उपन्यास दोहरी रंग कस्पासे biosensor, नामित CaspaseTracker उत्पन्न। इस रणनीति के ड्रोसोफिला जी ट्रेस FRT recombinase प्रणाली 34 के साथ ड्रोसोफिला कस्पासे संवेदनशील Apoliner biosensor 28 का एक संशोधित संस्करण को जोड़ती है स्थायी रूप से लेबल और इन विवो में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए। &lt;sup&gt; 35 Gal4 सक्रिय जी का पता लगाने प्रणाली caspases का स्तर बहुत कम CaspaseTracker सक्रिय करने के लिए, कोशिका द्रव्य और किसी भी सेल कि कभी कस्पासे गतिविधि का अनुभव है में स्थायी परमाणु-लक्षित GFP अभिव्यक्ति में आरएफपी अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप अनुमति देता है। 35 इस प्रणाली के लेबल कर सकते हैं ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, caspases और कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए एक विनयशील और व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल प्रणाली का उपयोग कर पूरे पशुओं में जीवन भर कोशिकाओं। 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

वहाँ दो प्रमुख घटक है कि CaspaseTracker सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। इनमें से पहले एक 146 अमीनो एसिड कस्पासे cleavable पॉलीपेप्टाइड कस्?...

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In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

पूरे जानवरों है कि कस्पासे गतिविधि के निम्न स्तर को रोकने में स्वस्थ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, अत्यधिक संवेदनशील नामित CaspaseTracker biosensor ड्रोसोफिला के लिए तैयार की गई थी। कस्पासे निर्भर biosensor गतिविधि मौत उत्तेजनाओं के अभाव में अनुकूलित शर्तों के तहत पाला वयस्क जानवरों के आंतरिक अंगों के दौरान लंबे समय रहते स्वस्थ कोशिकाओं में पाया जाता है।

विवो बायोसेंसर पटरियों ड्रोसोफिला में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

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Mesoscopic प्रतिदीप्ति के लिए टोमोग्राफी में इन विवो विकसित करने की इमेजिंग ड्रोसोफिला</em

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