Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

Vi takker Polan Santos og Darren Obbard for Drosophila illustrasjoner i fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena for bruk av JHMRI insectary. Dette arbeidet ble støttet av Life Science Research Foundation fellesskap (HLT), Universitetet Grants Committee of Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), og NIH gir NS096677, NS037402 og NS083373 (JMH). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow av Life Sciences Research Foundation.

1. Utarbeidelse av CaspaseTracker Fluer <ol><li> For å forberede CaspaseTracker (DQVD) flyr for eksperimenter, utfører dette korset: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi&gt; Stopp&gt; GFP-NLS), ved å overføre 7-10 jomfru kvinne (eller mann) fluer bærer caspase biosensor underlaget mCD8-DIAP1-Gal4 drevet av ubiquitin promoter 35 sammen med like mange menn (eller kvinne) G-TRACE fluer, som har andre kromosomet cYO balancer for å unngå dødelighet av homozygot kombinasjo...

Her viser vi bygg- og driften av CaspaseTracker som letter påvisningen av utbredt basal caspase aktivitet i friskt vev. De kritiske trinn for å detektere ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet in vivo, er: 1) generering av fluer med biosensoren transgenet, 2) verifisering av caspase-spesifikk rapportørfunksjon med hensiktsmessige kontroller, 3) å praktisere disseksjon teknikker for å observere alle interne systemer av voksen Drosophila organ, og 4) skille biosensor aktivitet fra autofluorescent gjenst...

Caspases er cystein proteaser som medierer apoptotisk celledød ved å spalte mange intracellulære proteiner etter nøkkel aspartat rester. For eksempel, initiativtaker caspases aktivere effektor caspases, derepress DNA nukleaser, hold fast cytoskeletal komponenter og endre lipid sammensetningen av cellemembraner for å raskt demontere celler og stimulere deres anerkjennelse og engulfment av naboceller som avhende celle lik. 1-4 Det er anslått at milliarder av celler dør per dag i menneskekroppen, og apoptose er en viktig mekanisme av kjemoterapi-indusert tumor celledød. 5 et annet sett av caspaser kan føre til celledød ved distinkte ikke-apoptotiske prosesser for å stimulere medfødt immunitet. 6 Derfor det meste av forskningen på caspases har fokusert på sine pro-døden funksjoner. Interessant, tidlig bevis i feltet viste at de samme caspases ansvarlig for å fremme celledød har også ikke-døden functions. Banebrytende studier har vist at caspaser er involvert i forskjellige cellulære funksjoner i friske celler, inkludert regulering av celleproliferasjon og migrering under embryogenese. 7-9 Kaspaser er nødvendig for individualisering spermatid i Drosophila 10,11, for blokkering av en alternativ reaksjonsvei necroptotic celledød i mus 12,13, og for mikroRNA behandling i C. elegans. 14,15 i kanskje den lengste levetid celler, nerveceller, caspases og andre apoptotisk maskiner er involvert i reguleringen av neuronal aktivitet ved beskjæring synaptiske avslutninger, en prosess antas å være avgjørende for å styrke andre synapser for læring og hukommelse. 16- 18 Det er mulig at caspases lette synaptiske beskjæring av en type mini-apoptose av ørsmå nevrale projeksjoner uten hele celledød. 19 Men caspases kan ha alternative funksjoner som ikke er relatert til apoptose-lignende hendelser. 20,21 Dual rolles i liv og død er ikke unikt for caspases; BCL-2 familie proteiner og cytokrom c har roller i mobilnettet energetikk i friske celler, men er også en del av kjernen apoptotiske sti som aktiveres av mange typer stress i cellene. 22-25 Selv om det ikke bevist, virker det logisk at evolusjon har koblet dag -jobs til døds jobber innenfor de samme molekylene å sikre rettidig eliminering av uegnede eller uønskede celler. I dag er de molekylære mekanismene for ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet ikke er forstått, og graden av ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet under embryonal utvikling og i voksent vev er heller ikke kjent. En stor utfordring er vanskeligheten med å skille dagsjobber fra døds jobber av kaspaser. I motsetning til apoptose og pyroptosis, når caspase aktivitet forsterkes av et proteolytisk kaskade, er de dag jobber av caspases forventes å skje på mye lavere nivå av enzymatisk aktivitet, trolig under påvisning av mange tilgjengelige technologies. Før arbeidet som presenteres her, andre utviklet en rekke caspase biosensorer for ulike formål. SCAT biosensorer (f.eks ECFP-DEVD-Venus) raskt oppdage sanntid caspase aktivitet i dyrkede celler og animalsk vev ved hjelp av gnage. 26,27 Ved caspase cleavage, den atom målrettet GFP-delen av Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) gjennomgår subcellulære relocalization i løpet av minutter når sin plasmamembran-tjore spaltes av kaspaser. 28 Tilsvarende ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes fra cytosol til kjernen på caspase cleavage. 29,30 Mer nylig, kromoforen i iCasper ble ekspedert konstruert til å fluorescere når spaltet av kaspaser, som tillater deteksjon av biosensor aktivitet i sanntid i neuroner i Drosophila embryo, men først og fremst i forbindelse med utviklings celledød. 31 Caspase-avhengig død av olfactory neuroner i løpet av aldring var demonstrerer atvurdert ved immun-påvisning av caspase-spaltet form av CPV biosensorer (f.eks mCD8-PARP-Venus). 32,33 Viktigere, ble den aktiverte formen av caspase-3 detekteres i fravær av celledød ved sensitive immunfarging i ryggrader av dyrkede nerveceller, og i soma med caspase-avhengig fluorescens av atom CellEvent reporter fargestoff, men noe var vanskelig på grunn av foto-toksisitet, selv om celledød ble utsatt til etter ryggraden eliminering. 19 Dermed nye caspase biosensorer for å oppdage og spor celler med basal kaspase-aktivitet in vivo. For å overvinne disse vanskelighetene, genererte vi en ny tofarget caspase biosensor, betegnet CaspaseTracker. Denne strategien kombinerer en modifisert versjon av Drosophila caspase-sensitive Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinase system 34 for permanent å merke og spore-celler in vivo. &lt;sup&gt; 35 GAL4-aktivert G-TRACE system tillater meget lave nivåer av caspaser å aktivere CaspaseTracker, noe som resulterer i RFP ekspresjon i cytoplasma og faste kjerne målrettet GFP-ekspresjon i en hvilken som helst celle som noensinne har opplevd kaspase-aktivitet. 35 Dette systemet kan merke celler i hele livet i hele dyr ved hjelp av Drosophila melanogaster, en medgjørlig og mye brukt modellsystem for studier av kaspaser og celledød. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Det er to viktige komponenter som gjør at CaspaseTracker å oppdage caspase aktivitet i normale friske celler (Figur 1a). Den første av disse er et 146 aminosyre caspase-spaltbare polypeptid modellert etter caspase biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Dette polypeptid er avledet fra DIAP1 (Drosophila inhibitor av apoptose) inneholdende et enkelt naturlig forekommende kaspase område som blir spaltet i løpet av apoptose typisk av caspa...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

For å detektere friske celler i hele dyr som inneholder lave nivåer av kaspase-aktivitet, ble den meget følsomme biosensor betegnet CaspaseTracker generert for Drosophila. Caspase-avhengig biosensor-aktivitet er detektert i langlivede friske celler gjennom de indre organer hos voksne dyr oppdrettet i henhold optimaliserte betingelser i fravær av døds stimuli.

In vivo Biosensor Tracks Non-apoptotiske caspase aktivitet i Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

En In vivo Crosslinking Approach å isolere protein komplekser Fra Drosophila Embryo

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling av Larve Aktiviteten i<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Sanntid i Vivo innspilling av Arabidopsis kalsium signaler under insekt fôring med et fluorescerende Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...