Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
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Agradecemos Polan Santos e Darren Obbard para Drosophila ilustrações Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para a utilização do insetário JHMRI. Este trabalho foi apoiado pela irmandade Fundação Life Science Research (HLT), University Grants Comissão do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de Pesquisa Ciências da Vida.

1. Preparação de Moscas CaspaseTracker <ol><li> Para preparar CaspaseTracker (DQVD) voa para experimentos, executar esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Parar&gt; GFP-NLS), através da transferência de 7-10 fêmea virgem (ou masculino) moscas que transporta o substrato da caspase-biossensor mCD8 DIAP1-Gal4 dirigido pelo promotor de ubiquitina de 35 em conjunto com o mesmo número do macho (ou fêmea) G-moscas de rastreio, que têm o segundo equilibrador cro...

Aqui ilustramos da construção e interiores funcionamento do CaspaseTracker que facilitam a detecção de atividade de caspase basal generalizada nos tecidos saudáveis. Os passos críticos para detectar a actividade de caspase não apoptótica in vivo são os seguintes: 1) a geração de moscas com o transgene biossensor, 2) verificar a função repórter específicos da caspase com controlos adequados, 3) praticando técnicas de dissecação para observar todos os sistemas de órgãos internos de adulto ...

As caspases são proteases de cisteína que medeiam a morte celular por apoptose por clivagem de muitas proteínas intracelulares após resíduos aspartato-chave. Por exemplo, caspases iniciadoras activar as caspases efectoras, as nucleases de ADN desreprimir, componentes do citoesqueleto e clivam alterar a composição lipídica das membranas celulares para desmantelar rapidamente as células e estimular o seu reconhecimento por células e imersão que eliminam os cadáveres célula vizinha. Estima-se 4/1 que milhares de milhões de células morrem por dia no corpo humano, e a apoptose é um importante mecanismo de morte de células tumorais induzida por quimioterapia. 5 um conjunto diferente de caspases podem causar morte celular por processos não apoptóticas distintas para estimular a imunidade inata. 6 Portanto, maioria das pesquisas sobre caspases tem se concentrado em suas funções pró-extermínio. Curiosamente, os primeiros indícios no campo revelou que os mesmos caspases responsáveis ​​pela morte celular promovendo também têm não-morte funções. Estudos pioneiros demonstraram que as caspases estão envolvidas em diversas funções celulares em células saudáveis, incluindo a regulação da proliferação e migração celular durante o desenvolvimento embrionário. 7-9 As caspases são necessários para a individualização espermátide em Drosophila 10,11, para o bloqueio de uma via de morte celular alternativa necroptotic em ratinhos 12,13, e para o processamento de microARN em C. elegans. 14,15 Em talvez o mais longevo células, neurônios, caspases e outra maquinaria apoptótica estão implicados na regulação da actividade neuronal pela poda terminações sinápticas, um processo que se acredita ser essencial reforçar outras sinapses de aprendizagem e memória. 16- 18 é possível que as caspases facilitar poda sináptica por um tipo de mini-apoptose de pequenas projecções neuronais sem morte de células inteiras. 19 No entanto, as caspases podem ter funções alternativas não relacionados com acontecimentos de apoptose semelhante. 20,21 papel duplos na vida e morte não são exclusivos para caspases; BCL-2 proteínas da família e citocromo c têm papéis em energetics celulares em células saudáveis, mas também são parte da via apoptótica núcleo que é ativado por muitos tipos de stress celular. 22-25 Embora não esteja provado, parece lógico que a evolução tem ligado dia -jobs to death-empregos dentro das mesmas moléculas para assegurar a eliminação atempada das células impróprias ou indesejáveis. Actualmente, os mecanismos moleculares da actividade de caspase não apoptóticas não são compreendidas, e o grau de actividade de caspase não apoptótica, durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos, também não é conhecido. Um grande desafio é a dificuldade em distinguir dia-empregos da morte-empregos de caspases. Em contraste com a apoptose e pyroptosis, quando a actividade de caspase é amplificada por uma cascata proteolítica, é esperado que os trabalhos de dia-caspases para ocorrer a níveis muito mais baixos de actividade enzimática, provavelmente abaixo de detecção disponível por muitos Technologies. Antes do trabalho aqui apresentado, outros desenvolveram uma variedade de biossensores de caspase para fins diferentes. Os biossensores SCAT (por exemplo, ECFP-DEVD-Vénus) detectar rapidamente a actividade da caspase em tempo real e em células em cultura de tecidos animais usando FRET 26,27. Após a clivagem de caspase, a porção da GFP dirigido ao núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sofre relocalização subcelular em poucos minutos quando o seu plasma membrana de tirante é clivada por caspases. 28 do mesmo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes a partir do citosol para o núcleo por clivagem de caspase. 29,30 Mais recentemente, o cromóforo em iCasper foi habilmente manipulada para fluorescência quando clivada por caspases, que permite a detecção da actividade de biossensor em tempo real, nos neurónios de embriões de Drosophila, mas principalmente em associação com o desenvolvimento da morte celular. morte 31 de caspase-dependente de neurónios olfactivos durante o envelhecimento estava demonstavaliado por imuno-detecção da forma clivada da caspase-biossensores de CPV (por exemplo, mCD8-PARP-Vénus). 32,33 modo importante, a forma activada da caspase-3 foi detectada na ausência de morte celular por imunocoloração sensível nas espinhas de neurónios em cultura, e no soma utilizar a fluorescência dependente da caspase do corante repórter CellEvent nuclear, mas foram encontradas dificuldades devido a foto-toxicidade, embora a morte celular foi atrasada até depois da eliminação da coluna. 19 Assim, novos biossensores caspases são necessários para detectar e rastrear células com atividade caspase basal in vivo. Para superar essas dificuldades, geramos um romance dupla biossensor cor caspase, designado CaspaseTracker. Esta estratégia combina uma versão modificada da Drosophila sensível caspase-Apoliner biossensor 28 de Drosophila com o G-rastreio do sistema de recombinase FRT 34 para etiquetar de forma permanente e acompanhar as células in vivo. &lt;sup&gt; 35 O sistema G-TRACE Gal4-activado permite níveis muito baixos de caspases para ativar CaspaseTracker, resultando na expressão RFP no citoplasma e permanente expressão GFP nuclear-alvo em qualquer célula que já experimentou a atividade da caspase 35 Este sistema pode rotular. células ao longo da vida em animais inteiros utilizando Drosophila melanogaster, um sistema modelo tratável e amplamente usados para o estudo de caspases e morte celular 36-38.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Existem dois componentes principais que permitem CaspaseTracker para detectar a actividade da caspase em células saudáveis normais (Figura 1A). O primeiro deles é um polipéptido de caspase-clivável 146 aminoácidos modelada após a caspase biossensor Apoliner (Figura 1b) 28 Este polipéptido é derivado de DIAP1 (inibidor de Drosophila de apoptose), contendo um único local de caspase de ocorrência natural que é clivado durante...

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In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

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