Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

Мы благодарим Polan Сантос и Даррен Obbard для дрозофилы иллюстраций на рис. 2а, Марсело Якобс-Лорена для использования инсектарий JHMRI. Эта работа была поддержана стипендией Research Foundation Life Science (ГВУ), Комитет Гранты Университета Гонконга AoE / B-07/99 (MCF) и NIH предоставляет NS096677, NS037402 и NS083373 (JMH). Хо Лам Тан является Shurl и Кей Курчи Foundation сотрудник Life Sciences Research Foundation.

1. Приготовление CaspaseTracker Мух <ol><li> Для подготовки CaspaseTracker (DQVD) мух для экспериментов, выполнить этот крест: UBI-CaspaseTracker х G-TRACE (UAS-RFP; UAS-ФЛП; Ubi&gt; Стоп&gt; GFP-NLS), путем передачи 7-10 девственница (или мужчина) мух , несущий каспазы биосенсора субстрат mCD8-DIAP1-GAL4 движимый убиквитин промотора...

Здесь мы проиллюстрируем строительные и внутренние работы CaspaseTracker, которые облегчают обнаружение широко распространенного базальной активности каспазы в здоровых тканях. Критические шаги для обнаружения не-апоптический активность каспазы в естественных условиях являются: 1) ф?...

Каспазы цистеиновых протеаз, которые опосредуют апоптотической гибели клеток путем скола много внутриклеточных белков после ключевых остатков аспарагиновой. Например, инициатор каспазы активировать эффекторные каспазы, derepress нуклеазы ДНК, понадеясь компоненты цитоскелета и изменяет липидный состав клеточных мембран , чтобы быстро ликвидировать клетки и стимулировать их признание и полном охвате соседними клетками, располагающие клеточных трупов. 1-4 Подсчитано что миллиарды клеток умирают в день в человеческом теле, и апоптоз является важным механизмом вызванной химиотерапией смерти опухолевых клеток. 5 Другой набор каспаз может привести к гибели клеток с помощью различных не-апоптотических процессов для стимуляции врожденного иммунитета. 6 Таким образом, большинство исследований каспаз была сосредоточена на своих функций про-смерти. Интересно, что первые данные в поле показали, что одни и те же каспазы несут ответственность за развитие клеточной смерти также необрывающегося пУНКЦИИ. Пионерские исследования показали , что каспазы участвуют в различных клеточных функций в здоровых клетках, в том числе регуляции клеточной пролиферации и миграции в процессе эмбриогенеза. 7-9 Каспазы требуется для индивидуализации сперматид в дрозофилы 10,11, для блокирования альтернативного necroptotic гибель клеток пути у мышей 12,13, а также для обработки микроРНК в C. Элеганс. 14,15 В , возможно , самой долгоживущей клетки, нейроны, каспазы и другие апоптическая машины участвуют в регуляции активности нейронов по обрезке синаптических окончаний, процесс считается необходимым для укрепления других синапсов для обучения и памяти 16 - ти. 18 возможно , что каспазы облегчают синаптическую обрезку по типу мини-апоптозу крошечных нейрональных проекций без всей клеточной гибели. 19 Тем не менее, каспазы могут иметь альтернативные функции , не связанные с апоптозом , как события. 20,21 Двойная рольs в жизни и смерти не являются уникальными для каспаз; BCL-2 белки семейства и цитохром с играют свою роль в клеточных энергетики в здоровых клетках , но также являются частью основного пути апоптоза , который активируется многими типами клеток стресса. 22-25 Хотя это и не доказано, что кажется логичным , что эволюция связана день -jobs до смерти-рабочих мест в рамках одних и тех же молекул, чтобы обеспечить своевременное устранение непригодных или нежелательных клеток. В настоящее время молекулярные механизмы, не апоптотической активности каспазы не поняты, и степень не-апоптотической активности каспазы во время эмбрионального развития и во взрослых тканях также не известно. Главной проблемой является трудность в различении однодневные рабочие места от смертельных заданий каспаз. В отличие от апоптоза и pyroptosis, когда активность каспазы усиливается протеолитического каскада, днем ​​рабочих мест каспаз, как ожидается, произойдет при гораздо более низких уровней ферментативной активности, вероятно, ниже обнаружения с помощью множества доступных техничтодологии. До начала работы, представленной здесь, другие разработали различные каспазы биосенсоры для различных целей. Копро биосенсоры (например, ECFP-DEVD-Венера) быстро обнаруживать активность каспазы в режиме реального времени в культивируемых клетках и тканях животных с использованием FRET. 26,27 При каспазы расщепления, то GFP фрагмент Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- ядерных целевых nucGFP) подвергается внутриклеточную релокализация в течение нескольких минут , когда его плазмалеммы-фал расщепляется каспазы. 28 Точно так же, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes из цитоплазмы в ядро при каспазы расщепления. 29,30 Подробнее в последнее время хромофора в iCasper был искусно разработан флуоресцировать при расщеплении с помощью каспаз, что позволяет обнаруживать биосенсора активности в реальном масштабе времени в нейронах Drosophila эмбрионов, но в первую очередь в связи с развитием клеточной гибели. 31 каспазы-зависимую гибель обонятельных нейронов при старении было demonstоценили иммунологического обнаружения каспазы-расщепляется форме КНД биосенсоров (например, mCD8-ППА-Венера). 32,33 Важно отметить, что активированная форма каспазы-3 был обнаружен в отсутствие гибели клеток путем чувствительной immunostain в корешках культивированные нейроны, а в соме с использованием каспазы-зависимой флуоресценции CellEvent репортерного красителя ядерной, но трудности возникли из - за фото-токсичности, хотя гибель клеток было отложено до после устранения позвоночника. 19 Таким образом, новые каспаз биосенсоры необходимы для обнаружения и отслеживать клетки с базальной активности каспазы в естественных условиях. Для преодоления этих трудностей, мы получили новый двойной цвет каспазы биосенсора, обозначенный CaspaseTracker. Эта стратегия сочетает в себе модифицированную версию Drosophila каспазы-чувствительных Apoliner биосенсора 28 с Drosophila G-волоконные системы FRT рекомбинантному 34 постоянно маркировать и отслеживать клетки в естественных условиях. &lt;SUP&gt; 35 Gal4-активированная система G-TRACE позволяет очень низкие уровни каспазы активировать CaspaseTracker, что приводит к экспрессии RFP в цитоплазме и постоянное выражение ядерной мишенью GFP в любой клетке, которая когда- либо испытывали активность каспазы. 35 Эта система может маркировать клетки на протяжении жизни в целом животных с использованием дрозофилы, послушным и широко используется модель системы для изучения каспаз и гибели клеток. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Есть два ключевых компонента , которые позволяют CaspaseTracker обнаружить активность каспазы у нормальных здоровых клеток (рис 1а). Первый из них представляет собой 146 аминокислоты каспазы-расщепляться полипептид по образцу каспазы биосенсора Apoliner (рисунок 1b).<...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Для того, чтобы обнаружить здоровые клетки в целых животных , которые содержат низкие уровни активности каспазы, высокочувствительный биосенсор назначенный CaspaseTracker был сгенерирован для дрозофилы. Каспазы-зависимой биосенсора обнаруживается активность в долгоживущих здоровых клетках во внутренних органах взрослых животных, выращенных в оптимальных условиях при отсутствии стимулов смерти.

В Vivo биосенсоров Треки Non-апоптотической активности каспазы в Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Запись в реальном времени в Vivo Arabidopsis кальция сигналов во время Насекомое кормления с использованием флуоресцентных биосенсор

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...