Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
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Agradecemos a Polan Santos y Darren Obbard para las ilustraciones de Drosophila en la Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para el uso del insectario JHMRI. Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida (HLT), Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AOE / B-07/99 (MCF), y el NIH subvenciones NS096677, NS037402 y NS083373 (JMH). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci miembro de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

1. Preparación de las moscas CaspaseTracker <ol><li> Para preparar CaspaseTracker (DQVD) vuela de experimentos, realice esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Stop&gt; GFP-nls), mediante la transferencia de 7-10 hembra virgen (o macho) las moscas que lleva el sustrato de la caspasa-biosensor mCD8 DIAP1-Gal4 impulsada por el promotor de ubiquitina 35 junto con el mismo número de hombres (o mujeres) moscas G-TRACE, que tienen el segundo cromosoma equilibrador Cy...

A continuación se ilustra la construcción y el funcionamiento interno de CaspaseTracker que facilitan la detección de la actividad de caspasa basal generalizada en los tejidos sanos. Los pasos críticos para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica in vivo son: 1) la generación de moscas con el transgén biosensor, 2) verificar la función reportero-caspasa específico con controles apropiados, 3) la práctica de técnicas de disección para observar todos los sistemas de órganos internos de...

Las caspasas son proteasas de cisteína que median la muerte celular por apoptosis mediante la escisión de muchas proteínas intracelulares después de residuos de aspartato clave. Por ejemplo, caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras, nucleasas de ADN derepress, componentes del citoesqueleto escinden y alteran la composición de lípidos de las membranas celulares para desmantelar rápidamente las células y estimular su reconocimiento y la inmersión por las células que disponen de los cadáveres célula vecina. 1-4 Se estima que miles de millones de células mueren por día en el cuerpo humano, y la apoptosis es un mecanismo importante de la muerte de células tumorales inducida por la quimioterapia. 5 un conjunto diferente de las caspasas puede causar la muerte celular por procesos no apoptóticas distintas para estimular la inmunidad innata. 6 por lo tanto, mayoría de las investigaciones sobre las caspasas se ha centrado en sus funciones a favor de la muerte. Curiosamente, las primeras pruebas en el campo reveló que los mismos caspasas responsables de promover la muerte de las células también tienen no la muerte funciones. Estudios pioneros han demostrado que las caspasas están implicadas en diversas funciones celulares en las células sanas, incluyendo la regulación de la proliferación celular y la migración durante la embriogénesis. 7-9 se requieren caspasas para la individualización spermatid en Drosophila 10,11, para el bloqueo de una vía de la muerte celular necroptotic alternativa en ratones 12,13, y para el procesamiento de microARN en C. . elegans 14,15 En quizás los más longevos células, las neuronas, las caspasas y otra maquinaria apoptótica están implicados en la regulación de la actividad neuronal mediante la poda de terminaciones sinápticas, un proceso que se cree que es esencial para el fortalecimiento de otras sinapsis para el aprendizaje y la memoria 16-. 18 es posible que las caspasas facilitar la poda sináptica por un tipo de mini-apoptosis de las proyecciones neuronales diminutas sin muerte de células enteras. 19 sin embargo, las caspasas pueden tener funciones alternativas no relacionadas con eventos de apoptosis similares. 20,21 papel Duals en la vida y la muerte no son exclusivos de las caspasas; BCL-2 y proteínas de la familia del citocromo c tienen papeles en la energética celular en las células sanas, pero también son parte de la ruta apoptótica núcleo que se activa por muchos tipos de estrés celular. 22-25 Aunque no está comprobado, parece lógico que la evolución ha vinculado día -Jobs hasta la muerte, puestos de trabajo en las mismas moléculas para asegurar la eliminación oportuna de las células no aptas o no deseables. En la actualidad, los mecanismos moleculares de la actividad de caspasa no apoptótico no se entienden, y el grado de actividad de la caspasa no apoptótico durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos también no se conoce. Un reto importante es la dificultad de distinguir día-trabajos desde death-puestos de trabajo de las caspasas. En contraste con la apoptosis y pyroptosis, cuando la actividad de caspasa se amplifica por una cascada proteolítica, se espera que los trabajos diurnos de las caspasas se produzca a niveles mucho más bajos de actividad enzimática, probablemente por debajo de la detección por muchos tecn disponiblesgías. Antes del trabajo presentado aquí, otros desarrollaron una variedad de biosensores de caspasa para diferentes propósitos. Los biosensores de SCAT (por ejemplo, ECFP-DEVD-Venus) detectar rápidamente la actividad de caspasa en tiempo real en células cultivadas y tejidos animales utilizando FRET. 26,27 Tras la escisión de la caspasa, la fracción GFP dirigido al núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sufre relocalización subcelular dentro de minutos cuando su membrana de sujeción plasma es escindido por las caspasas. 28 del mismo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocaliza desde el citosol al núcleo tras la escisión de la caspasa. 29,30 Más recientemente, el cromóforo en iCasper fue diseñado inteligentemente a emitir fluorescencia cuando se escinde por caspasas, lo que permite la detección de la actividad de biosensor en tiempo real en las neuronas de embriones de Drosophila, pero principalmente en asociación con la muerte celular de desarrollo. muerte 31 dependiente de caspasa de las neuronas olfativas durante el envejecimiento estaba demonstclasificado por inmuno-detección de la forma de la caspasa-escindido de biosensores CPV (por ejemplo, mCD8-PARP-Venus). 32,33 Es importante destacar que, se detectó la forma activada de la caspasa-3 en ausencia de muerte celular por inmunotinción sensible en espinas de neuronas cultivadas, y en el soma usando la fluorescencia dependiente de caspasa del colorante indicador CellEvent nuclear, pero se encontraron dificultades debido a la foto-toxicidad, aunque la muerte celular se retrasa hasta después de la eliminación columna vertebral. 19 por lo tanto, se necesitan nuevos biosensores caspasas para detectar y realizar un seguimiento de las células con actividad de caspasa basal in vivo. Para superar estas dificultades, hemos generado un nuevo biosensor de color caspasa doble, designado CaspaseTracker. Esta estrategia combina una versión modificada del biosensor Apoliner Drosophila caspasa-sensible 28 con el sistema FRT recombinasa Drosophila G-TRACE 34 para etiquetar y rastrear células en vivo de forma permanente. &lt;sup&gt; 35 El sistema G-TRACE activado-Gal4 permite que los niveles muy bajos de caspasas para activar CaspaseTracker, lo que resulta en la expresión de RFP en el citoplasma y la expresión de GFP dirigido al núcleo permanente en cualquier célula que nunca ha experimentado la actividad de caspasa. 35 Este sistema puede etiquetar las células durante toda la vida en animales enteros utilizando Drosophila melanogaster, un sistema modelo tratable y ampliamente utilizado para el estudio de las caspasas y la muerte celular. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Existen dos componentes clave que permiten CaspaseTracker para detectar la actividad de la caspasa en las células sanas normales (Figura 1A). El primero de ellos es un polipéptido de la caspasa-escindible 146 amino ácido el modelo de la caspasa biosensor Apoliner (Figura 1b). 28 Este polipéptido se deriva de DIAP1 (inhibidor de Drosophila de apoptosis) que contiene un único sitio de la caspasa natural que se escinde durante la ap...

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In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

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