Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

Vi tackar Polan Santos och Darren Obbard för Drosophila illustrationer i Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena för användning av JHMRI insectary. Detta arbete stöddes av Life Science Research Foundation gemenskap (HLT), University Nämndens i Hongkong AoE / B-07/99 (MCF), och NIH bidrag NS096677, NS037402 och NS083373 (JMH). Ho Lam Tang är en Shurl och Kay Curci Foundation Fellow av Life Sciences Research Foundation.

1. Framställning av CaspaseTracker Flies <ol><li> För att förbereda CaspaseTracker (DQVD) flyger för experiment, utföra inlägg: UBI-CaspaseTracker x G-trace (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi&gt; Stopp&gt; GFP-NLS), genom att överföra 7-10 virgin kvinnor (eller män) flugor bär kaspas biosensor substratet mCD8-DIAP1-Gal4 driven av ubikitinpromotorn 35 tillsammans med samma antal män (eller kvinna) G-TRACE flugor, som har den andra kromosomen cyo balancer att undvika letaliteten av den homozy...

Här visar vi bygg- och inre arbetet i CaspaseTracker som underlättar upptäckt av omfattande basal kaspas-aktivitet i friska vävnader. De kritiska stegen för detektering av icke-apoptotiska kaspas-aktivitet in vivo är: 1) att generera flugor med biosensor transgen, 2) kontrollera kaspas-specifik reporter funktion med lämpliga kontroller, 3) tränar dissekering tekniker för att observera alla system av vuxna Drosophila inre organ, och 4) särskiljande biosensoraktivitet från autofluorescerande a...

Kaspaser är cysteinproteaser som förmedlar apoptotisk celldöd genom att klyva många intracellulära proteiner efter viktiga aspartat rester. Till exempel, initiator kaspaser aktivera effektor kaspaser, derepress DNA nukleaser, klyver cytoskelettala komponenter och förändra lipidkompositionen av cellmembran för att snabbt avveckla celler och stimulera deras erkännande och omvälvning av angränsande celler som omhändertar cell lik. 1-4 Det uppskattas att miljarder celler dör per dag i den mänskliga kroppen, och apoptos är en viktig mekanism för kemoterapiinducerad tumörcelldöd. 5 en annan uppsättning av caspaser kan orsaka celldöd av distinkta icke-apoptotiska processer för att stimulera medfödd immunitet. 6 Därför den mesta forskningen på kaspaser har fokuserat på sina pro-döden funktioner. Intressant tidiga tecken på området visade att samma kaspaser ansvarar för att främja celldöd har också icke-död fSpecialfunktioner. Banbrytande studier har visat att kaspaser är involverade i olika cellulära funktioner i friska celler, inklusive reglering av celltillväxt och migration under fosterutvecklingen. 7-9 Kaspaser krävs för spermatid individualisering i Drosophila 10,11, för att blockera ett alternativ necroptotic celldöd vägen i möss 12,13, och mikroRNA bearbetning i C. elegans. 14,15 I kanske längsta bodde celler, neuroner, kaspaser och andra apoptotiska maskiner är inblandade i regleringen av nervaktivitet genom beskärning synaptiska ändelser, en process tros vara nödvändigt att stärka andra synapser för inlärning och minne. 16- 18 Det är möjligt att kaspaser underlättar synaptiska beskärning av en typ av mini-apoptos av små neuronala projektioner utan hela celldöd. 19 emellertid kaspaser kan ha alternativa funktioner inte har samband med apoptos-liknande händelser. 20,21 dubbla rollsi liv och död är inte unika för kaspaser, BCL-2 familjeproteiner och cytokrom c har roller i cell energier i friska celler, men är också en del av kärnan apoptotiska vägen som aktiveras av många typer av cellstress. 22-25 Även om det inte bevisat, verkar det logiskt att evolutionen har kopplat dag -jobb till döds jobb inom samma molekyler för att snabbt avskaffa olämpliga eller oönskade celler. För närvarande är de molekylära mekanismerna för icke-apoptotiska kaspas-aktivitet inte förstått, och omfattningen av icke-apoptotiska kaspas aktivitet under embryonal utveckling och i vuxna vävnader är inte heller känt. En stor utmaning är att det är svårt att skilja dagsjobb från döds jobb kaspaser. I motsats till apoptos och pyroptosis, när kaspasaktivitet förstärks av en proteolytisk kaskad, är dags jobb kaspaser förväntas ske vid mycket lägre nivåer av enzymatisk aktivitet, sannolikt under upptäckt av många tillgängliga teknologies. Före det arbete som presenteras här, andra utvecklat en rad olika caspase biosensorer för olika ändamål. Scat biosensorer (t.ex. ECFP-DEVD-Venus) snabbt upptäcka realtid kaspas-aktivitet i odlade celler och djurvävnader med hjälp av FRET. 26,27 Vid caspase klyvning, kärn riktade GFP delen av Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) genomgår subcellulära relocalization inom några minuter när dess plasmamembran-tjuder klyvs av kaspaser. 28 Likaså ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes från cytosolen till kärnan på caspase klyvning. 29,30 Mer nyligen kromoforen i iCasper skickligt konstruerad för att fluorescera när klyvs av kaspaser, medger detektering av biosensoraktivitet i realtid i nervceller i Drosophila embryon, men framför allt i samband med utvecklings celldöd. 31 kaspas-beroende död lukt neuroner under åldrandet var demonstrankad av immuno-detektion av kaspas-klyvd form av CPV biosensorer (t.ex. mCD8-PARP-Venus). 32,33 Viktigt var den aktiverade formen av kaspas-3 detekterades i frånvaro av celldöd genom känsliga immunostain i taggar i odlade nervceller, och i soma med hjälp av kaspas-beroende fluorescens av kärn CellEvent reporter färgämne, men svårigheter påträffades på grund av fototoxicitet, men celldöd försenades tills efter eliminering ryggraden. 19 Således nya kaspas biosensorer behövs för att upptäcka och spåra celler med basal kaspas-aktivitet in vivo. För att övervinna dessa svårigheter, genererade vi en ny dubbel färg kaspas biosensor, betecknad CaspaseTracker. Denna strategi kombinerar en modifierad version av Drosophila kaspas känsliga Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinassystem 34 för att permanent märka och spåra celler in vivo. &lt;sup&gt; 35 Den Gal4-aktiverade G-TRACE systemet tillåter mycket låga nivåer av kaspaser att aktivera CaspaseTracker, vilket resulterar i RFP uttryck i cytoplasman och permanent kärninriktade GFP-uttryck i någon cell som någonsin har upplevt kaspas-aktivitet. 35 Detta system kan märka celler under hela livet i hela djur med användning av Drosophila melanogaster, en lätthanterlig och mycket använt modellsystem för studium av kaspaser och celldöd. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Det finns två viktiga komponenter som gör det möjligt CaspaseTracker att upptäcka kaspas-aktivitet i normala friska celler (Figur 1A). Den första av dessa är en 146 aminosyra kaspas-klyvbar polypeptid modellerad efter kaspas biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Denna polypeptid är härledd från DIAP1 (Drosophila inhibitor av apoptos) innehållande en enda naturligt förekommande caspas webbplats som klyvs under apoptos typiskt av...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

För att detektera friska celler i hela djur som innehåller låga halter av kaspas-aktivitet, var mycket känsliga biosensorn betecknad CaspaseTracker genereras för Drosophila. Kaspas-beroende biosensor aktivitet upptäcks i långlivade friska celler genom de inre organen av vuxna djur som fötts upp under optimerade betingelser i frånvaro av döds stimuli.

In Vivo Biosensor Tracks Icke-apoptotiska kaspasaktivitet i Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging av intakt Drosophila Larver på sub-cellulära upplösning

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Ett In vivo Tvärbindning metod att isolera proteinkomplex från Drosophila Embryon

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Realtid i Vivo inspelning av Arabidopsis kalcium signaler under insekt utfodring med hjälp av en fluorescerande Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...