Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

Biz Şekil Drosophila çizimler için Polan Santos ve Darren Obbard teşekkür ederiz. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena JHMRI insectary kullanımı için. Bu çalışma Hayat Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenmiştir, Üniversite Ödenekler Komitesi Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) ve NIH NS096677, NS037402 ve NS083373 (JMH) verir. Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.

CaspaseTracker Sineklerin hazırlanması 1. <ol><li> Bu haç gerçekleştirmek, CaspaseTracker (DQVD) hazırlamak deneyler için uçar için: 7-10 bakire kadın aktarılması (ya da erkek) tarafından, UBI-CaspaseTracker G-İZ (Ubi&gt; Dur&gt; GFP-nls;; UAS-FLP UAS-RFP) x kaspaz biyosensör substrat mCD8-DIAP1-Gal4 taşıyan erkek (ya da kadın) aynı sayıda ubikutin destekleyicisi 35 araya tarafından G- homozigot kombinasyonu ölümcül önlemek için ikinci kromozom CYO dengeleyici ola...

Burada sağlıklı dokularda yaygın bazal kaspaz aktivitesinin saptanmasını kolaylaştırmak CaspaseTracker inşaat ve iç işleyişini göstermektedir. In vivo olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) 2) uygun kontroller ile kaspaz-özel raportör fonksiyonu doğrulayarak, 3) diseksiyon tekniklerini uygulayarak yetişkin Drosophila tüm iç organ sistemlerini gözlemlemek, biyosensör transgen ile sinekleri üreten, autofluorescent eserler gelen ve 4)...

Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. 1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. 5 caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için farklı olmayan apoptotik süreçler tarafından hücre ölümüne neden olabilir. 6 bu nedenle, kaspaslara çoğu araştırma yanlısı ölüm fonksiyonları üzerine yoğunlaşmıştır. İlginç bir şekilde, alanda dair kanıtlar teşvik hücre ölümünden sorumlu olan kaspaz non ölüm f olduğunu ortayaonksiyonlar ı. Öncü çalışmalar kaspazlar embriyojenez esnasında hücre çoğalması ve göçünün düzenlenmesinde dahil olmak üzere sağlıklı hücrelerde çeşitli hücresel fonksiyonları yer aldığını göstermiştir. 7-9 Kaspazlar alternatif necroptotic hücre ölüm yolunu bloke etmek için, Drosophila 10,11 spermatid Kişiselleştirme için gereklidir farelerde 12,13 ve mikroRNA işleme C. elegans. 14,15 belki de en uzun ömürlü hücreler, nöronlar, kaspaz ve diğer apoptotik makine sinaptik sonlar budama yoluyla nöronal aktivitenin düzenlenmesinde rol olan, inanılan bir süreç öğrenme ve hafıza için diğer sinaps güçlendirmek için önemli olduğu. 16- 18 kaspazlar bütün hücre ölümü olmadan minik nöronal projeksiyonları mini apoptoz bir türüne göre sinaptik budama kolaylaştırmak mümkündür. 19 Bununla birlikte, kaspaz apoptoz gibi olaylara ilgisiz alternatif işlevlere sahip olabilir. 20,21 Çift rolüyaşam ve ölüm s caspases özgü değildir; Kanıtlanmış olmasa da BCL-2 ailesi proteinleri ve sitokrom-c sağlıklı hücrelerde hücresel enerji endüstrisinde rol var ama aynı zamanda hücre stres birçok türleri tarafından aktive edilir çekirdek apoptotik yolun bir parçasıdır. 22-25, evrim gün bağlantılı olduğu mantıklı görünüyor uygun olmayan veya istenmeyen hücrelerin zamanında eleme sağlamak için aynı moleküllerden içinde ölüm işlere -iş. Şu anda, apoptotik olmayan kaspaz etkinliğinin moleküler mekanizmalar anlaşılmamıştır ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi bulunması da bilinmemektedir. Büyük bir meydan okuma caspases ölüm işlerden gün işleri ayırmada zorluk olduğunu. kaspaz aktivitesi bir proteolitik akışı ile amplifiye edilir apoptoz ve pyroptosis, aksine, kaspaz günlük iş mevcut olan birçok techn göre büyük olasılıkla algılanan değer altına enzimatik aktivite çok daha düşük seviyelerde olması beklenmektedirologies. Burada sunulan çalışma öncesinde, diğerleri farklı amaçlar için kaspaz biyosensörler çeşitli geliştirdi. SCAT biyosensörler (örneğin, ECFP-DEVD-Venüs) hızla FRET kullanarak kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında gerçek zamanlı kaspaz aktivitesini algılar. 26,27 kaspaz bölünme üzerine, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nükleer hedefli GFP kısmı nucGFP) plazma membran bağlama caspase&#39;lar tarafından yarılır dakika içinde hücre içi yerini değiştirmesi geçirmektedir. 28 Benzer şekilde, ApoAlert-pCaspase3 Sensör (NES-DEVD-YFP NLS) kaspaz yarılma üzerine çekirdeğe sitosolden relocalizes. 29,30 fazlası son zamanlarda, iCasper içinde kromofor akıllıca Drosophila embriyo nöronların gerçek zamanlı olarak biyosensör etkinliğinin bulgulanması izin kaspaz parçalanabilen, ancak öncelikle gelişimsel hücre ölümü ile ilişkili olarak kaldığında parlayan şekilde işleme sokuldu. koku nöronların 31 Kaspaz bağımlı ölüm olduğu yaşlanma sırasında demonstGBM biyosensörler (örneğin, bunun ardından mCD8-PARP Venüs) kaspaz-klivaj formunun immüno-algılama derecelendiren. 32,33 Önemli olarak, kaspaz-3 aktive edilmiş şekli dikenler duyarlı immunostain hücre ölümünün kaybolması saptandı kültürlü nöronlar ve soma nükleer CellEvent raportör boyanın kaspaz-bağımlı floresan kullanılarak, ancak hücre ölümü omurga eleme sonrasına kadar ertelendi olmasına rağmen zorluklar nedeniyle foto-toksisite rastlanmıştır içinde. 19 Böylece, yeni kaspaz biyosensörler algılamak için gerekli olan ve in vivo bazal kaspaz aktivitesi ile hücreleri izlemek. Bu zorlukları aşmak için, biz CaspaseTracker belirlenen yeni çift renkli kaspaz biyosensör, oluşturulan. Bu strateji kalıcı etiket ve in vivo hücreleri izlemek için Drosophila G-İZ FRT rekombinaz sistemi 34 ile Drosophila kaspaz-duyarlı Apoliner biyosensör 28 değiştirilmiş bir sürümü birleştirir. &lt;sup&gt; 35 Gal4 aktive G-TRACE sistemi. caspases çok düşük seviyelerde hiç kaspaz aktivitesini yaşadı herhangi bir hücrede sitoplazma ve kalıcı bir nükleer hedefli GFP ifade RFP ifade sonuçlanan CaspaseTracker etkinleştirmek için izin verir 35 Bu sistem etiketleyebilirsiniz Drosophila melanogaster, kaspaz ve hücre ölümü çalışma için izlenebilir ve yaygın olarak kullanılan bir model sistemi kullanarak tüm hayvanlarda ömrü boyunca hücreleri. 36-38

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">A22284</td>
			<td>Actin stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:225px;">Antibody Registry ID:&#160; AB_528218&#160;</td>
			<td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36934</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:225px;">P36961</td>
			<td>to preserve fluorophores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:229px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Product code: 0001023934</td>
			<td>for dissection plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

CaspaseTracker normal sağlıklı hücreleri (Şekil 1a) kaspaz aktivitesini algılamasına izin iki önemli bileşeni vardır. Bunlardan ilki, kaspaz biyosensör Apoliner (Şekil 1b) örnek alınarak 146 amino asit kaspaz-bölünebilir polipeptiddir. Bu polipeptid tipik olarak apoptoz sırasında bölünen tek bir doğal olarak oluşan kaspaz bölgesi içeren DIAP1 (apoptoz Drosophila inhibitörü) türetilir 28 kaspaz ile drice. <su...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila at JoVE.com

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...