Name: in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart
Uploaded: 2016-04-27T14:00:00
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इस काम के ड्यूक-एनयूएस ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल सिंगापुर, गोह नींव और सिंगापुर एनआरएफ फैलोशिप (एनआरएफ-NRFF2016-01) मानवेंद्र कुमार सिंह से धन के द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी प्रयोगों ड्यूक-एनयूएस ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 1. भ्रूण निलय पुन: प्राप्त <ol><li> वांछित भ्रूण चरण (E11.5 या E12.5) कार्बन डाइऑक्साइड ग?...

<ol>
	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+epithelial+to+mesenchymal+transitions+in+heart+development+and+disease.">Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease.</a> Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Dev Cell. 22, 639-650 (2012).</li><li>Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-processing+enzyme+Dicer+is+required+in+epicardium+for+coronary+vasculature+development.">MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development.</a> J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).</li><li>Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+under+development:+cardiovascular+embryology+applied+to+heart+disease.">New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease.</a> J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).</li><li>Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cardiac+mesenchymal+stem+cells:+expanding+the+outer+limit+of+heart+repair.">Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair.</a> Circ Res. 110, 904-906 (2012).</li><li>Manner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+formation+of+the+epicardium+in+chick+embryos.">Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos.</a> Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).</li><li>Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

यह तकनीक है कि epicardium के अध्ययन की सुविधा हृदय के विकास और उत्थान में epicardium के बढ़ते महत्व को पूरा करने के लिए विकसित करने के लिए निर्णायक है। epicardial संस्कृति प्रणाली epicardial अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण लाभ बन गया ...

प्रयोगात्मक डेटा का खजाना है कि epicardium हृदय विकास में महत्वपूर्ण कदम प्रभावित करती है सचित्र है। विकास के दौरान, पट transversum mesothelial proepicardium 1-4 रूप में जाना जाता कोशिकाओं का एक पेड़ों का झुरमुट को जन्म देता है। proepicardium से कोशिकाओं तो विस्थापित और मायोकार्डियम epicardium गठन लिफाफा। इस के बाद, epicardial कोशिकाओं के एक सबसेट epicardium व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) है कि बाद में मायोकार्डियम पर आक्रमण के एक प्रवासी आबादी के लिए EMT जन्म देने से गुजरना। जेनेटिक रूप में अच्छी तरह रेट्रोवायरल वंश प्रयोगों अनुरेखण दिखा दिया है कि EPDCs चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं और cardiomyocytes (यदि हो तो) सहित विभिन्न प्रजातियों में अंतर है। इसलिए EPDCs कोरोनरी वाहिका और दौरे वास्तुकला 1,2,4-9 के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करते हैं। इसके अलावा, epicardium वेंट्रिकुलर कॉम्पैक्ट परत 10-12 के विकास के लिए आवश्यक है। ई के लिएXAMPLE Gittenberger-de Groot एट अल। दिखा दिया है कि proepicardium के परिणाम बाधा इस तरह के एक पतली मायोकार्डियम, दिल और असामान्य interventricular पट गठन की कमी पाशन के रूप में और एक परिणाम है, भ्रूण मारक 13 के रूप में दोष की एक सरणी के लिए होता है। भ्रूण epicardium से स्रावित पैराक्राइन कारकों cardiomyocyte प्रसार और भेदभाव मिलाना। इस के साथ संगत, ऐसे retinoic एसिड (आरए), fibroblast वृद्धि कारक (FGFs) और Wnt / β-catenin के रूप में संकेत दे रास्ते के epicardium-विशिष्ट विलोपन दोषपूर्ण दौरे विकास और भ्रूण मारक 14-16 में हुई। हालांकि epicardium वयस्क दिलों में मौन माना जा रहा था, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि विकास कार्यक्रम हृदय चोट 17,18 निम्नलिखित epicardium में सक्रिय है। सक्रियण पर, कोशिकाओं तेजी से प्रसार और EMT कि EPDC गठन में परिणाम से गुजरना। इन कोशिकाओं को capacit का प्रदर्शनY fibroblast और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, लेकिन नहीं cardiomyocytes या endothelial कोशिकाओं 18 में अंतर करने के लिए। इसके अलावा, EPDCs proangiogenic कारक है कि घायल क्षेत्र के vascularization में सहायता और इस तरह रोधगलितांश आकार कम करने से हृदय समारोह में सुधार की सुविधा छिपाना। इन निष्कर्षों के कारण, epicardium हृदय विकास, रोग और उत्थान के अध्ययन में ब्याज का फायदा हुआ है। ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी 21 वीं सदी में चिकित्सा अनुसंधान क्रांति ला दी है। ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों की सहायता के साथ, रोगग्रस्त माउस पाचन और pathophysiologically मानव हालत नकल उतार मॉडल को सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। हालांकि, इन म्यूटेंट में epicardial सेल व्यवहार का अध्ययन मुख्य रूप से जल्दी भ्रूण मारक के कारण एक चुनौती रहा है। महत्वपूर्ण भूमिका है कि epicardium हृदय विकास और उत्थान में खेलता ध्यान में रखते हुए, हम माउस epicardia के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणाली की स्थापना की हैएल कोशिकाओं। इस विधि epicardial कोशिकाओं की लंबी अवधि संस्कृति की अनुमति देता है और epicardium के दो महत्वपूर्ण गुणों का विस्तृत अध्ययन की सुविधा: विस्थापित और अंतर करने की क्षमता। माउस से excised निलय कोलेजन जैल जो प्रवास assays के संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर संवर्धित किया जा सकता है। एक 3 डी मैट्रिक्स है कि कोलेजन युक्त subepicardial परत के बाह्य मैट्रिक्स बेहतर प्रतिकृति इन विवो सेल फिजियोलॉजी स्मरण दिलाता में संवर्धित किया जा रहा है। वैकल्पिक रूप से वे एक आदेश epicardial monolayer जो तब बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित करने के लिए कक्ष स्लाइड पर संवर्धित किया जा सकता है। इस monolayer तंग जंक्शन प्रोटीन है जो epicardium की क्षमता EMT गुजरना करने के लिए जो प्रवास के लिए महत्वपूर्ण है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा के लिए दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, भेदभाव प्रयोगों भी इन कोशिकाओं पर बाहर किया जा सकता है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल कोशिकाओं से शाही सेना निकालने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है औरमात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) प्रदर्शन। अन्त में, monolayers भी एक आणविक विश्लेषण के बाद संभावित चिकित्सा विज्ञान के लिए परीक्षण करने के लिए एजेंटों के साथ इलाज किया जा सकता है। एक साथ रखो, इस epicardial संस्कृति प्रणाली कल्पना और आणविक डेटा जो epicardial विकास के बारे में हमारी समझ को आगे इकट्ठा करने के लिए अवसर के साथ हमें प्रदान करता है। इस पद्धति का एक और वांछनीय विशेषता यह है कि यह स्पष्ट है और कोई विस्तृत सेटअप की आवश्यकता है। संक्षेप में, भ्रूण E11.5 या E12.5 जिसके बाद दिल excised है पर काटा जाता है। निलय तो या तो कोलेजन जेल या चैम्बर स्लाइड पर सुसंस्कृत हैं। बाद में, इन कोशिकाओं को नीचे की ओर प्रयोगों का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:131px;">Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11995065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td>10500064</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-5KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:131px;">PeproTech</td>
			<td style="width:131px;">450-33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td style="width:131px;">PeproTech</td>
			<td style="width:131px;">100-21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">ZO-1 antibody</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">40-2200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;">T 6074</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">&#945;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;">A 2547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Phalloidin antibody</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D Collagen Culture kit&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ECM 675</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well chamber slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NNU 154534-PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">15596-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td>4453536</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript First Strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">11904-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

इस संस्कृति प्रोटोकॉल का प्रयोग, प्राथमिक epicardial कोशिकाओं बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उच्च शुद्धता के साथ अलग किया जा सकता है। संवर्धित कोशिकाओं, EMT गुजरना विस्थापित और अंतर epicardial कोशिकाओं वि...

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In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

माउस भ्रूणीय दिल से एपिकार्डियल प्रकोष्ठों के इन विट्रो संस्कृति में

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

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