Name: through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

O protocolo seguinte utiliza parâmetros definidos pelas experiências nas Figuras 4 e 6 com respeito às definições de aquisição e condições experimentais. Muitos destes parâmetros pode ser modificado para caber outras experiências (isto é, os tempos de exposição, binning, canais fluorescentes, etc.). Todos os procedimentos devem aderir às diretrizes e regulamentos institucionais e ser aprovado pela comissão de biossegurança institucional. Web site do fa...

Vantagens de Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal O microscópio é um instrumento ideal para os estudos longitudinais de resposta à droga, uma vez que permite aos investigadores para rastrear as células individuais e os seus destinos, bem como a totalidade da população. A variabilidade na resposta à droga dentro de uma população de células é uma questão importante para anti-câncer projeto terapêutico. acompanhamento longitudinal de células indiv...

microscopia de células vivas e acompanhamento longitudinal de células individuais não é uma técnica nova. Desde os primeiros microscópios, os entusiastas e cientistas têm observado e estudado células individuais e organismos, seus comportamentos e desenvolvimento 1-3. Um exemplo famoso do falecido David Rogers na Universidade de Vanderbilt na década de 1950 mostra um neutrófilo humano em um esfregaço de sangue perseguindo uma bactéria Staphylococcus aureus e, eventualmente, o processo de fagocitose 4. Este filme-célula viva é um excelente exemplo de como os processos múltiplos podem ser observados e correlacionados em um único experimento: detecção de um gradiente químico, mecânica e velocidade da motilidade celular, celular formas dinâmicas, adesão e fagocitose de um patógeno. O advento de microscópios totalmente automatizados e câmeras digitais altamente sensíveis resultou em um aumento do número de investigadores por meio de microscopia de fazer perguntas fundamentais em biologia celular variando from como as células mover 5,6 e dividir 7,8 a organela dinâmica e tráfico de membrana 9-11. Não fluorescente, microscopia de campo claro, inclusive de contraste de fase (PC), que recebeu o Prêmio Nobel de Frits Zernike em 1953, e contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a observação de células e núcleos, mas também estruturas sub-celulares, incluindo feixes de microtúbulos , cromossomas, nucléolo, dinâmica de organelos, e fibras de actina grossas 12. Geneticamente codificado proteínas fluorescentes e no desenvolvimento de corantes fluorescentes contra organelas têm impactado drasticamente a microscopia de lapso de tempo 13-15. Embora não seja o foco deste artigo, a imagem latente em esferóides celulares e in situ (microscopia intravital) usando confocal e microscopia multiphoton representam uma nova expansão da abordagem, e há artigos pendentes que usam e discutir estas abordagens 16-19. As respostas de células a anti-Cancer drogas ou produtos naturais são determinados na escala molecular e celular. Compreender as respostas das células e destinos após o tratamento muitas vezes envolve a população ensaios de média (por exemplo., Immunoblotting, medidas bem inteiras), ou pontos de tempo fixos com a detecção de imunofluorescência e citometria de fluxo, que medem células individuais. A heterogeneidade das respostas de células únicas para fármacos dentro de uma população, em especial em tumores, pode explicar alguns dos a variabilidade na resposta observada através de linhas de células e tumores que são tratados com o mesmo fármaco em saturação. A longo prazo abordagens longitudinais seguir uma dada célula individual ou uma população de células é uma abordagem menos comum mas muito poderosa que permite o estudo directo de vias de resposta moleculares, diferentes fenótipos (por ex., Morte celular ou a divisão celular), a observação de variabilidade célula-a-célula dentro de uma população, e como estes factores contribuem para a dinâmica de resposta população 20-22. Optimista, podendopara observar e quantificar respostas de célula única vai ajudar a melhorar a nossa compreensão de como os medicamentos funcionam, por que eles às vezes não, e como melhor utilizá-los. A técnica de microscopia de longo prazo de lapso de tempo, o acompanhamento longitudinal e análise das respostas de drogas está disponível para muitos investigadores e pode ser simples, usando a luz transmitidas apenas para observar respostas fenótipo 20,21. Os principais componentes da abordagem incluem: preparação adequada das células de interesse, um microscópio automatizado com câmara ambiental, uma câmera integrada com um computador para adquirir e armazenar as imagens e software para analisar o lapso de tempo e medir e analisar as células e quaisquer biossensores fluorescentes. Nós fornecemos um protocolo detalhado com muitas dicas para a realização de microscopia de lapso de tempo de células cultivadas, enquanto vários dias usando claro e / ou microscopia de epifluorescência widefield. Este protocolo pode ser utilizado para qualquer linha de células que podem ser cultivadas em culturapara estudar as suas respostas às terapias anti-câncer. Nós fornecemos exemplos de dados adquiridos e analisados ​​utilizando vários biossensores fluorescentes geneticamente codificados diferentes e um exemplo de microscopia de contraste de fase, discutir brevemente os diferentes tipos de sondas, as vantagens e desvantagens de longo prazo de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal, o que pode ser aprendidas para esta abordagem que é difícil de compreender a partir de abordagens não-directos, e algumas variações que esperamos que venha a ser de interesse e valor para pesquisadores inexperientes que não ter considerado usando a abordagem, e para investigadores experientes.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Taxol (paclitaxel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7191</td>
			<td>microtubule stabilizing drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etoposide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1225</td>
			<td>topoisomerase II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>selinexor</td>
			<td>Karyopharm Therapeutics</td>
			<td>na</td>
			<td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-5 inhibitor</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>na</td>
			<td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell growth medium</td>
			<td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td>
			<td></td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/balance air, certified</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7222004379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm 4 well dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35C4-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, gridded glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well, glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-UCB controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR LumenPro200</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Lumen200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR Proscan III motorized stage</td>
			<td>Prio Scientific</td>
			<td>H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEV chamber</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Controller Unit</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA light engine</td>
			<td>lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td>
			<td>ANDOR&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOKAI HIT inclubation chamber</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

A resposta de células únicas para fármacos anti-cancro contribui significativamente para a determinação da resposta da população, e, portanto, é um factor importante que contribui para o resultado global. Immunoblotting, citometria de fluxo e experimentos com células fixas são frequentemente usados ​​para estudar como as células respondem a drogas anti-câncer. Estes métodos são importantes, mas eles têm várias deficiências. A variabilidade nas respostas ao fármaco entre o cancro e as células normais, e entre células de cancro de origem diferente, e transiente e respostas raras são difíceis de entender utilizando ensaios de média da população e sem ser capaz de controlar directamente e analisá-las longitudinalmente. O microscópio é particularmente bem adequado para células vivas imagem. Os avanços na tecnologia permitem-nos rotineiramente células de imagens em uma resolução que permite não só o acompanhamento de células, mas também a observação de uma variedade de respostas celulares. Nós descrevemos uma abordagem pormenorizada que permita a imagem contínua de lapso de tempo decélulas durante a resposta da droga para, essencialmente, desde que desejado, tipicamente até 96 horas. Utilizando variantes da abordagem, as células podem ser monitorados durante semanas. Com o emprego de codificados geneticamente biossensores fluorescentes numerosos processos, caminhos e respostas pode ser seguido. Mostramos exemplos que incluem acompanhamento e quantificação do crescimento celular e na progressão do ciclo celular, a dinâmica de cromossomas, danos no ADN e morte celular. Discutimos, também, variações da técnica e sua flexibilidade, e destacar algumas armadilhas comuns.

Longo prazo microscopia de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal direta permite o estudo de muitos efeitos anti-câncer durante a resposta à droga. Seguindo o esquema geral na Figura 1, vários exemplos de células são mostradas expressar repórteres fluorescentes validados que tratada com drogas anti-cancro, rastreados e analisados ​​utilizando diferentes abordagens. Microscopia de contraste de f...

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Medicina

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

A administração intranasal de Terapêutica do SNC para Ratos Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Pulse Wave Velocity Testing in the Baltimore Longitudinal Study of Aging

Pulso de onda Velocity Ensaios no Estudo Longitudinal de Envelhecimento de Baltimore

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive ...

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Confocal Time Lapse de imagem como um método eficiente para a Avaliação citocompatibilidade of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

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In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...