Name: through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Följande protokoll använder parametrar som definieras av experimenten i figurerna 4 och 6 om förvärv inställningar och experimentella förhållanden. Många av dessa parametrar kan modifieras för att passa andra experiment (dvs exponeringstider, binning, fluorescerande kanaler, osv.). Alla förfaranden måste följa institutionens riktlinjer och föreskrifter och godkännas av den institutionella biosäkerhet kommittén. Mikroskop tillverkare webbplatser innehål...

Fördelar med Time-lapse Mikroskopi och Längs Tracking Mikroskopet är ett idealiskt instrument för longitudinella studier av läkemedelssvar eftersom det tillåter utredarna att spåra enskilda celler och deras öden, liksom hela befolkningen. Variabilitet i läkemedelssvar inom en population av celler är en viktig fråga för anti-cancer terapeutisk design. Längsgående spårning av enskilda celler kan utredarna att observera denna variation och börjar förstå de bak...

Live-cell mikroskopi och längsgående spårning av enskilda celler är inte en ny teknik. Från de tidigaste mikroskop, har entusiaster och forskare observerat och studerat enskilda celler och organismer, deras beteenden och utveckling 1-3. Ett berömt exempel från slutet av David Rogers vid Vanderbilt University i 1950-talet visar en humant neutrofilt i en blodutstryk jagar en Staphylococcus aureus bakterie och slutligen processen för fagocytos 4. Denna levande celler film är ett utmärkt exempel på hur flera processer kan observeras och korreleras i ett enda experiment: avkänning av en kemisk gradient, mekanik och hastighet av cellrörlighet, formar cell dynamik, vidhäftning och fagocytos av en patogen. Tillkomsten av helautomatiska mikroskop och mycket känsliga digitalkameror har resulterat i ett ökande antal forskare som använder mikroskopi för att ställa grundläggande frågor i cellbiologi sträcker from hur celler rör sig 5,6 och dela 7,8 till organell dynamik och membranhandel 9-11. Icke-fluorescerande, bright mikroskopi, inklusive faskontrast (PC), som samlade Nobelpriset för Frits Zernike i 1953, och differential interferens kontrast (DIC) möjliggöra observation av celler och kärnor utan även subcellulära strukturer inklusive mikrotubuli buntar , kromosomer, nukleolerna, organell dynamik, och tjocka aktinfibrer 12. Genetiskt kodade fluorescerande proteiner och utveckling av fluorescerande färger mot organ har dramatiskt påverkat time-lapse mikroskopi 13-15. Även om inte i fokus för denna artikel, avbildning i cell sfäroiderna och in situ (intravital mikroskopi) med hjälp av konfokal och multifoton mikroskopi representerar en annan expansion av tillvägagångssättet, och det finns utestående artiklar som använder och diskutera dessa metoder 16-19. Svaren av celler till anti-cancER läkemedel eller naturprodukter fastställs på molekylär och cellulär nivå. Förstå cellsvar och öden efter behandling innebär ofta befolkningsmedelvärdesanalyser (t ex., Immunoblotting, hela och åtgärder), eller fasta tidpunkter med immunofluorescens detektion och flödescytometri, som mäter enskilda celler. Heterogenitet i enkelcellsvar på läkemedel inom en population, i synnerhet i tumörer, kan förklara en del av variationen i svaret som ses tvärs cellinjer och tumörer som behandlas med samma läkemedel vid mättnad. Långsiktig longitudinella metoder för att följa en given enda cell eller en population av celler är en mindre vanlig men mycket kraftfull metod som gör det möjligt att direkt studera molekylära svarsvägar, olika fenotyper (eg., Celldöd eller celldelning), observation av cell till cell variation inom en population, och hur dessa faktorer bidrar till befolkningssvarsdynamik 20-22. Optimistiskt, att kunnaatt observera och kvantifiera enskilda cellsvar kommer att förbättra vår förståelse för hur läkemedel fungerar, varför de ibland misslyckas, och hur man bäst använder dem. Tekniken långsiktiga time-lapse mikroskopi, längsgående spårning och analys av svaren drog är tillgänglig för många forskare och kan vara enkel, med enbart transmitterat ljus för att observera fenotyp svar 20,21. De viktigaste komponenterna i metoden omfattar: lämplig beredning av cellerna av intresse, ett automatiserat mikroskop med miljökammare, en kamera integrerat med en dator för att förvärva och lagra bilder, och programvara för att granska tidsförlopp och mäta och analysera cellerna och eventuella fluorescerande biosensorer. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll med många tips för att utföra tidsförlopp mikroskopi av odlade celler så länge som flera dagar att använda bright och / eller widefield epifluorescent mikroskopi. Detta protokoll kan användas för någon cellinje som kan odlas i kulturatt studera deras svar på anti-cancerterapier. Vi ger exempel på data som samlats in och analyserades med hjälp av flera olika genetiskt kodade fluorescerande biosensorer och ett exempel på faskontrastmikroskopi, kort diskutera olika typer av sönder, fördelar och nackdelar med långsiktig time-lapse och längsgående spårning, vad kan vara omar för detta synsätt som är svårt att förstå från icke-direkta metoder, och vissa variationer som vi hoppas kommer att vara av intresse och värde för oerfarna forskare som inte har övervägt att använda tillvägagångssättet, och erfarna forskare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Taxol (paclitaxel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7191</td>
			<td>microtubule stabilizing drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etoposide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1225</td>
			<td>topoisomerase II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>selinexor</td>
			<td>Karyopharm Therapeutics</td>
			<td>na</td>
			<td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-5 inhibitor</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>na</td>
			<td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell growth medium</td>
			<td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td>
			<td></td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/balance air, certified</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7222004379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm 4 well dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35C4-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, gridded glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well, glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-UCB controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR LumenPro200</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Lumen200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR Proscan III motorized stage</td>
			<td>Prio Scientific</td>
			<td>H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEV chamber</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Controller Unit</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA light engine</td>
			<td>lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td>
			<td>ANDOR&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOKAI HIT inclubation chamber</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

Svaret hos enstaka celler till anti-cancerdroger väsentligt bidrar i fastställandet av befolkningen respons, och därför är en stor bidragande faktor i den övergripande resultatet. Immunoblotting, flödescytometri och fasta experiment cell används ofta för att studera hur celler svarar på anti-cancerdroger. Dessa metoder är viktiga, men de har flera brister. Variationen i svaren läkemedels mellan cancer och normala celler, och mellan celler av olika cancer ursprung och övergående och sällsynta reaktioner är svåra att förstå med hjälp av befolkningsmedelvärdesanalyser och utan att kunna direkt spåra och analysera dem i längdriktningen. Mikroskopet är särskilt väl lämpad för bild levande celler. Framsteg inom teknik ger oss möjlighet att rutinmässigt bildceller med en upplösning som möjliggör inte bara cell spårning, men också observation av en mängd olika cellulära svar. Vi beskriver en metod i detalj som gör det möjligt att kontinuerligt time-lapse avbildning avceller under läkemedelssvar för i huvudsak så länge som önskas, typiskt upp till 96 tim. Använda varianter av tillvägagångssättet, kan celler övervakas i veckor. Med anställning av genetiskt kodade fluorescerande biosensorer många processer, vägar och svar kan följas. Vi visar exempel som inkluderar spårning och kvantifiering av celltillväxt och cellcykelprogression, kromosomdynamik, DNA-skada, och celldöd. Vi diskuterar också variationer av tekniken och dess flexibilitet, och lyfta fram några vanliga fallgropar.

Långsiktig time-lapse mikroskopi och direkt längsgående spårning möjliggör studier av många anti-cancer effekter under läkemedelssvar. Efter den allmänna kontur i figur 1, är flera exempel på celler visas uttrycker validerade fluorescerande reportrar som behandlats med anti-cancerläkemedel, spårade, och analyseras med hjälp av olika metoder. Ensam faskontrastmikroskopi är mycket informativ och k...

Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Genom Looking Glass: Time-lapse Mikroskopi och Längs spårning av enskilda celler för att studera anti-cancer Therapeutics

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Metod för Novel läkemedel mot cancer utveckling med hjälp av tumör explants av kirurgiska preparat


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration av CNS Therapeutics att vakna möss

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Högupplöst<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknik för att studera dynamiska svaret för intrakraniell Structures till tumörtillväxt och Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation in i den främre ögonkammaren för längsgående, icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med encelliga Upplösning i realtid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Pulse Wave Velocity Testing in the Baltimore Longitudinal Study of Aging

Pulsvågshastighet Testning i Baltimore Longitudinal Study of Aging

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive ...

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Confocal Time Lapse Imaging som en effektiv metod för Cytocompatibility utvärdering av Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo Imaging och spårning av teknetium-99m märkt benmärg mesenkymala stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Utökad Time-lapse Intravital avbildning av realtid flercelliga Dynamics i tumörens mikro

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinell<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Cerebrovasculature Relevans till CNS-sjukdomar

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...