Name: in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

نشكر لوسي براون والكسندر Spalla من التحليل الخلوي الأساسية في مدينة الأمل للمساعدة في الفرز. ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01DK081587 وR01DK099734 إلى HTK، وU01DK089533 لADR، ومعهد المؤسسة الوطنية للعلوم منحة جبهة الخلاص الوطني DMR-1206121 وكاليفورنيا للطب التجديدي منحة RB5-07398 إلى DAT يدعم من معهد جوزيف جيه جاكوبس للهندسة الجزيئية للطب في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا لDAT، وتلك من مؤسسة أوكسنارد ومؤسسة إيلا فيتزجيرالد إلى HTK أيضا امتنان. التمويل: ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01DK081587 وR01DK099734 إلى HTK، وU01DK089533 لADR، ومعهد المؤسسة الوطنية للعلوم منحة جبهة الخلاص الوطني DMR-1206121 وكاليفورنيا للطب التجديدي منحة RB5-07398 ل DAT يدعم من جوزيف جيه جاكوبسكما اعترف معهد الهندسة الجزيئية للطب في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا لDAT، وتلك من مؤسسة أوكسنارد ومؤسسة إيلا فيتزجيرالد إلى HTK العرفان. وشمل البحث الذي نشر في هذا المنشور العمل المنجز في التحليل الخلوي الأساسية والخفيفة المجهري الأساسية التصوير الرقمي بدعم من معهد السرطان القومي التابع لمعاهد الصحة الوطنية تحت رقم جائزة P30CA33572. الراعي الدراسة: إن الراعي لا تشارك في تصميم الدراسة، وجمع، وتحليل، أو تفسير البيانات.

بيان الأخلاقي: ونحن نتمسك المعايير الأخلاقية المقبولة على نطاق واسع في إجراء البحوث لضمان جودة وسلامة النتائج. وتجري التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في مدينة الأمل. 1. إعداد تعليق...

<ol>
	<li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis.">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34(+)+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma.">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li><li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth.">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li><li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth.">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation.">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li><li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct,+Acinar,+and+Endocrine+Cells+In+Vitro.">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures.">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl/6+Mice.">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells.">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940 (2013).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar.">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li><li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin,+the+ligand+for+the+Mpl+receptor,+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice.">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li><li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors.">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148 (2011).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem/progenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium.">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation.">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting.">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li><li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice.">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li><li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss.">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li></ol>

المقايسات مستعمرة البنكرياس ومستعمرة واحدة التحليلات الموصوفة هنا كانت مستوحاة من المقايسات مستعمرة المكونة للدم التي تحتوي على ميثيل التي لعبت دورا رئيسيا في فك رموز بيولوجيا الخلايا الاصلية المكونة للدم في العقود الماضية 23. في هذه المقايسات (الشكل 5)،</s...

<html> ويتكون البنكرياس من ثلاثة الأنساب الخلية الرئيسية؛ خلايا عنيبية تفرز الإنزيمات الهضمية، القنوات الناقلة لإفراز الميوسين لدرء مسببات الأمراض ونقل الإنزيمات الهضمية إلى الأمعاء، وخلايا الغدد الصماء تفرز الهرمونات، بما في ذلك الأنسولين والجلوكاجون، التي تحافظ على مستوى السكر في التوازن. أثناء التطور الجنيني من البنكرياس، وخلايا الأقنية المبكرة هي مصدر الخلايا الاولية ثلاثي قوية قادرة على التسبب في الأنساب الثلاثة في بنكرياسات الحيوانات الكبار 1،2. لأن الجذعية والسلف الخلايا البالغة، مثل الخلايا الجذعية لنخاع العظم، وبالفعل استخدمت بنجاح لعلاج أمراض مختلفة 3، وهناك اهتمام كبير في العثور على الخلايا الجذعية والسلف في البنكرياس الكبار. إذا كانت العزلة والتلاعب من الخلايا الجذعية والسلف البنكرياس الكبار ممكنة، وهذه الخلايا يمكن استخدامها لعلاج أمراض مثل السكري من النوع 1، حيث يتم تدمير الخلايا المفرزة للأنسولين من قبل المناعة الذاتية. الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; سواء الخلايا الاولية ثلاثي قوي لا تزال موجودة في قنوات البنكرياس الكبار بعد الانتهاء من التطور الجنيني هو السؤال الذي يدور جدل كبير في الأوساط العلمية. في هذا النقاش، واستخدام في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، وأظهر تقنيات تتبع النسب INADA وزملاء العمل أن الكبار خلايا الأقنية الفئران المسمى مع علامة، الأنهيدراز الكربونيك الثاني، يمكن أن يؤدي إلى كل الأنساب البنكرياس ثلاثة 4. ومع ذلك، باستخدام علامات الأقنية الأخرى، مثل HNF1b 5 و Sox9 2، تم التوصل إلى أن خلايا الأقنية ليست هي المصدر الرئيسي للخلايا بيتا في فئران بالغة. قبل عدة سنوات، اقترحنا أن سبب النقاش المذكورة أعلاه قد يكون راجعا إلى نقص في مجال 6،7، من الأدوات التحليلية المناسبة التي يمكن استخدامها لقياس تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز اثنين والمعايير اللازمة ل تحديد الخلايا الجذعية. في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لتعقب النسب المذكورة تقنيةأعلى يمكن أن توفر دليلا على العلاقة سلف-ذرية على مستوى السكان. ومع ذلك، هذه النسب تقنية تتبع يقتصر في وسعها لتبين ما إذا كانت الخلايا السلف واحدة يمكن تجديد الذات وتفرق في الأنساب متعددة. تحليل وحيد الخلية هو المهم لأنه إذا تم تحليل عدة الأسلاف أحادية قوية، مع كل إمكانات النسب المختلفة، جنبا إلى جنب، فإنها قد تظهر مجتمعة أن يكون متعدد النسب قدرات التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية وعادة ما تكون طفيفة السكان من جهاز الكبار. يمكن ملثمين أنشطة سكان الخلية طفيفة من قبل سكاني كبير. ولذلك، فإن نتيجة سلبية من دراسة السكان لا يعني بالضرورة عدم وجود الخلايا الجذعية. وأخيرا، لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن نسب تتبع لا يسمح حاليا للقياس على تجديد الذات. للبدء في معالجة الفجوة التقنية في مجال البنكرياس بيولوجيا الخلية السلف، مستعمرة 7-11 أو عضوي الشكل 12-15 </suوقد ابتكر ص&gt; فحوصات باستخدام نظم استزراع 3D. وقد وضعت اثنين من المقايسات مستعمرة لالأسلاف البنكرياس في مختبرنا: واحد يحتوي على إعداد التجارية من الفئران البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) (انظر طرق ومعدات الجدول)، والآخر يحتوي على هيدروجيل laminin، وهو يعرف الاصطناعي البروتين ECM 7-11. يتم خلط الخلايا الاصلية في وسط شبه صلبة تحتوي على ميثيل. ميثيل هو مادة خاملة بيولوجيا ولزجة أعدت من ألياف الخشب، واستخدمت بشكل روتيني في المقايسات مستعمرة المكونة للدم (16). المتوسط ​​شبه صلبة تحتوي على ميثيل-يقيد حركة الخلايا الاولية واحدة بحيث لا يمكن إعادة مجموع المباراتين. ومع ذلك، فإن المتوسط ​​لينة بما يكفي للسماح لخلية سلفية لتنمو وتفرق في مستعمرة من الخلايا في الفضاء 3D. بعد تقليد أمراض الدم، كانت خلية سلفية البنكرياس التي كانت قادرة على التسبب في مستعمرة من الخلايا نآمد وحدة البنكرياس تشكيل مستعمرة (PCFU). PCFUs، عندما نمت في الفئران التي تحتوي على ECM مستعمرة الفحص، تؤدي إلى المستعمرات الكيسي التي يتم تسمية &quot;الطوق&quot; المستعمرات 7. على إضافة ناهض WNT، R-spondin1، في الثقافة التي تحتوي على ECM الفئران، تتحول بعض المستعمرات الدائري إلى مستعمرات &quot;كثيفة&quot; (7). في هذه المقالة، وهذين النوعين من المستعمرات نمت في الثقافة ECM الفئران يشار إليها مجتمعة ب &quot;حزام / الكثيفة&quot; المستعمرات. عندما يتم فصل الدائري / مستعمرات كثيفة في تعليق خلية واحدة، وإعادة مطلي إلى الثقافات التي تحتوي على laminin هيدروجيل، تتشكل &quot;الغدد الصماء / عنيبية&quot; المستعمرات 7. باستخدام مستعمرة واحدة تحليلات، تبين أن غالبية المستعمرات الدائري / الكثيفة والغدد الصماء / عنيبية، سواء من الكبار (عمرها شهر 2-4) (القديمة أسابيع 1) 7،11 أو الشباب 9 البنكرياس الفئران، وأعرب عن ثلاثة علامات النسب. وهذا يشير إلى أن معظم PCFUs الناشئة هي ثلاثية قوية. في التي تحتوي على ECM الفئران مستعمرة فحص وتجديد الذات الكبار PCFUs الفئران بقوة وتوسيع ما يقرب من 500،000 مرة على مدى 11 أسابيع في الثقافة 7. ECM الفئران يدعم تفضيلي تمايز الخلايا الأقنية على الغدد الصماء وعنيبية الأنساب، في حين أنه في وجود هيدروجيل laminin، تشجع PCFUs الفئران للتمييز تفضيلي إلى خلايا الغدد الصماء وعنيبية وأقل من ذلك إلى نسب الأقنية 7،9،11. الأهم من ذلك، الأنسولين + الجلوكاجون - يتم إنشاء خلايا أحادية الهرموني في الثقافة هيدروجيل laminin وتفرز الأنسولين استجابة إلى جلوكوز التحفيز في المختبر 7،9، مما يدل على النضج وظيفية. وأكد التمايز ثلاثي النسب المحتملة 7،9 وتجديد النفس 11 من PCFUs فرد من المجهرية وحيدة الخلية، أي زرع خلية واحدة لكل بئر لتشكيل مستعمرة. معا، وتوفر هذه النتائج دليل على أن هناك، ثلاثي الهياج تجديد الذاتر، وخلايا تشبه السلف في البنكرياس الفئران بعد الولادة التي تظهر الأنشطة في الثقافة 3D. وتستمد المقايسات PCFU الفئران الموضحة في هذه المقالة من مقايسة مستعمرة مسبق مصممة للخلايا السلف متباينة من الخلايا الفئران الجذعية الجنينية (mESCs) 17. تم توثيق هذا البروتوكول في التفاصيل في المنشور إن الرب آخر 18. المكونات والتقنيات اللازمة لأداء الفئران التي تحتوي على ECM فحص المستعمرة لPCFUs الكبار الثقافة هي نفسها بالنسبة للالأسلاف المستمدة مسك-17،18. لذلك، لن يتكرر هذه الجوانب من فحص هنا. بدلا من ذلك سيتم تناول الإجراءات التالية: 1) التفكك البنكرياس الكبار والفرز CD133 + Sox9 / EGFP + الخلايا الأقنية، والتي تثري PCFUs من فئران بالغة 7، 2) التلاعب وحيدة الخلية من الخلايا فرزها، 3) واحدة مستعمرة يحلل استخدام ميكروفلويديك QRT-PCR وكله جبل المناعية، و 4) تفكك كولونيالصورة في تعليق وحيد الخلية وإعادة الطلاء إلى ECM الفئران أو laminin المقايسات مستعمرة هيدروجيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Hydrogel</td>
			<td>Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td>
			<td></td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Flacon Conical vial</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mmx20mm Suspension culture dish</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase1</td>
			<td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td>
			<td>11088831001</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101310</td>
			<td>low endotoxin, azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>400522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133-Biotin</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-1331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Allophycocyanin</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>3571</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mucin 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td>
			<td>HM-1630-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>127-495-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td>
			<td>101</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>0017-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T-4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40um Filter Mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um filter mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 96 Well Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924 (Previously 83.1835)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48.48 Dyanmic Array Chip</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>BMK-M-48.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>85000800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm petri dish with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Piece/ Rubber Tubing</td>
			<td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td>
			<td>MP-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin B</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>659-AB</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendin 4</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>E7144</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&#160;</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Black Well Plate</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flat, clear bottom with lid.&#160; Black polystyrene TC-treated microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD&#160;</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas

الجذعية والخلايا الاولية من البنكرياس الكبار يمكن أن يكون مصدرا محتملا للخلايا تشبه بيتا العلاجية لعلاج المرضى الذين يعانون من داء السكري من النوع 1. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الجذعية والسلف خلايا موجودة في البنكرياس الكبار. وقد أسفرت استراتيجيات البحث باستخدام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن البحث عن المفقودين النسب في فئران بالغة النتائج التي إما دعم أو دحض فكرة أن خلايا بيتا يمكن أن تتولد من القنوات، ومكان يفترض حيث يمكن أن يقيم الكبار الأسلاف البنكرياس. هذه الأساليب لتعقب النسب في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، ومع ذلك، لا يمكن الإجابة على الأسئلة على تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز اثنين والمعايير اللازمة لتحديد الخلايا الجذعية. للبدء في معالجة هذه الفجوة التقنية، ونحن وضعت المقايسات مستعمرة 3 الأبعاد لالأسلاف البنكرياس. بعد فترة وجيزة نشر الأولي لدينا، وضعت غيرها من المختبرات بشكل مستقل مماثل، ولكن ليست متطابقة، طريقة تسمى الفحص عضوي الشكل. بالمقارنة مع فحص عضوي الشكل، ويعمل لدينا وسيلةميتيل، التي تشكل الحلول اللزجة التي تسمح للإدراج البروتينات المصفوفة خارج الخلية بتركيزات منخفضة. تسمح المقايسات التي تحتوي على ميثيل أسهل كشف وتحليل الخلايا الاولية على مستوى وحيدة الخلية، التي تعتبر بالغة الأهمية عندما تشكل الأسلاف صغيرة شبه سكان، كما هو الحال بالنسبة للعديد من الخلايا الجذعية الجهاز الكبار. معا، والنتائج من عدة مختبرات يتظاهرون في المختبر تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز الخلايا الشبيهة السلف البنكرياس من الفئران. البروتوكولات الحالية تصف تحليلين مستعمرة القائم على ميثيل لتوصيف الأسلاف الماوس البنكرياس. واحد يحتوي على إعداد التجارية من البروتينات المصفوفة خارج الخلية الفئران والأخرى الاصطناعي خارج الخلية البروتين مصفوفة يعرف هيدروجيل laminin. التقنيات المعروضة هنا هي 1) التفكك البنكرياس والفرز من CD133 + Sox9 / EGFP + الخلايا الأقنية من فئران بالغة، 2) التلاعب خلية واحدة من لياليخلايا orted، 3) مستعمرة واحدة تحلل باستخدام ميكروفلويديك QRT-PCR وكله جبل المناعية، و 4) تفكك المستعمرات الأولية إلى وحيدة الخلية تعليق وإعادة الطلاء، إلى فحوصات مستعمرة الثانوية لتقييم التجديد الذاتي أو تمييز.

الخلايا الاولية البنكرياس الكبار يمكن إثراء مضان تنشيط الخلايا الفرز (الشكل 1). وقد ولدت Sox9 / EGFP خط الماوس المعدلة وراثيا المستخدمة هنا لأول مرة نتيجة لمشروع GENSAT الدماغ أطلس 19، ومراسل EGFP تحت سيطرة كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

في المقايسات مستعمرة المختبر للكشف عن تجديد الذات والتمايز للخلايا السلف عزل من البنكرياس الفئران الكبار وضعها. في هذه المقايسات، الأسلاف البنكرياس تؤدي إلى مستعمرات الخلايا في الفضاء 3 الابعاد في المتوسطة التي تحتوي على ميثيل شبه صلبة. ووصف بروتوكولات للتعامل مع الخلايا وحيدة وتوصيف المستعمرات الفردية.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

عزل خلايا Mesangiogenic السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) من نخاع العظام البشرية

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

نقص الأكسجين المسبق للخلية السلف المستمدة من نخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق الخلوي للتحقيق في تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام والبلعمه من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...