Name: in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

אנו מודים לוסי בראון ואלכסנדר Spalla מהליבה Cytometry האנליטי של עיר של תקווה עבור סיוע במיון. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך ממכון ג&#39;ייקובס יוסף י להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן קרן אוקסנרד ואלה פיצג&#39;רלד קרן כדי HTK גם הודתה בהכרת תודה. מימון: עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך מן יוסף י ג&#39;ייקובסמכון להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן אוקסנרד קרן ואלה פיצג&#39;רלד קרן כדי HTK גם הודו בהכרת תודה. מחקר מדווח בפרסום זה כלל את עבודות שבוצעו Core ההדמיה הדיגיטלי המיקרוסקופי Core Cytometry אנליטית האור הנתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב תחת מספר פרסי P30CA33572. מחקר חסות: נותן החסות לא להשתתף בעיצוב המחקר, איסוף, ניתוח, או פרשנות של נתונים.

הצהרה אתית: אנו דבקי הסטנדרטים האתיים מקובל מחקר כדי להבטיח את האיכות ואת היושרה של התוצאות. ניסויים בבעלי חיים נערכים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש ב העיר של תקווה. 1. כן השעית תא בודד מתוך למבוגרים Murin...

<ol>
	<li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis.">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34(+)+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma.">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li><li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth.">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li><li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth.">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation.">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li><li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct,+Acinar,+and+Endocrine+Cells+In+Vitro.">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures.">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl/6+Mice.">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells.">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940 (2013).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar.">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li><li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin,+the+ligand+for+the+Mpl+receptor,+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice.">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li><li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors.">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148 (2011).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem/progenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium.">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation.">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting.">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li><li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice.">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li><li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss.">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li></ol>

מבחני מושבת לבלב המושבה אחת ניתוחי המתואר כאן נוצרו בהשראת מבחני מושבת hematopoietic המכיל methylcellulose אשר שחקו תפקיד מכריע בפענוח הביולוגיה של תאי אבות היווצרות דם בעשורים האחרונים 23. מבחנים אלה (איור 5), תאים ניתקים לבלב הם מצופים לתוך methylcellulose המכיל תקשורת חצ?...

<html> הלבלב מורכב משלוש שושלות תאים עיקריות; תאים acinar להפריש אנזימי עיכול, צינוריות להפריש mucin להדוף פתוגנים ולהעביר אנזימי עיכול כדי במעיים, ותאי האנדוקרינית להפריש הורמונים, כולל אינסולין וגלוקגון, כי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז. במהלך ההתפתחות העוברית של הלבלב, תאי ductal מוקדם הם המקור של ובתאים תלת-עוצמה המסוגל והוליד שלושה שושלות של pancreata של בעלי חיים בוגרים 1,2. מכיוון שתאי גזע ובתאים מבוגרים, כגון תאי גזע ממוח העצם, כבר משמשים בהצלחה לטיפול במגוון מחלות 3, יש עניין רב במציאת תאי הגזע ועל מי שהגה בלבלב המבוגר. אם בידוד מניפולציה של תאי גזע ועל מי שהגה לבלב המבוגרים היו אפשריים, תאים אלה יכולים לשמש לטיפול במחלות כגון סוכרת מסוג 1, שבה תאי מפרישי האינסולין נהרסים על ידי אוטואימוניות. s = &quot;jove_content&quot;&gt; אם ובתאים תלת-עצמה עדיין קיימים צינוריות לבלב מבוגרות לאחר השלמת התפתחות עוברית היא שאלה התווכחה בכבדות בקהילה המדעית. בדיון זה, ושימוש in vivo cre-לקס השושלת-התחקות טכניקות, Inada ועמיתים לעבודה הראו כי תאי ductal בעכברים בוגרים שסומנו בסמן, anhydrase פחמתית השנייה, יכול מעוררים שלוש כל שושלות הלבלב 4. עם זאת, באמצעות סמנים ductal אחרים, כגון HNF1b 5 ו Sox9 2, זה היה להסיק כי תאים ductal אינם המקור העיקרי של תאי בטא בעכברים בוגרים. לפני מספר שנים, הצענו כי עילת הדיון הנ&quot;ל יכולה להיות בגלל החוסר, בתחום 6,7, של כלי אנליטיים מתאימים שיכול לשמש למדידת התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב שושלת צורך להגדיר תא גזע. טכניקת in vivo cre-לקס התחקות השושלת ציינההנ&quot;ל יכול לספק ראיות קשר הצאצאים-אב ברמת אוכלוסייה. עם זאת, טכניקת התחקות בשושלת זו מוגבלת שביכולתה כדי להבחין אם ובתאים יחידים יכולים עצמי לחדש להתמיין שושלות מרובות. ניתוח מתא בודד חשוב כי אם אבות מונו-עוצמה כמה, כל אחד עם פוטנציאל באים ממשפחות שונות, נותחו יחד, הם עשויים להופיע באופן קולקטיבי יש יכולות בידול רב השושלת. בנוסף, תאי גזע הם בדרך כלל אוכלוסיית קטין של איבר בוגר. הפעילות של אוכלוסיית תא קטין יכולה להיות רעולה פנים על ידי האוכלוסייה הגדולה. לכן, תוצאה שלילית ממחקר האוכלוסייה אינה מעידה בהכרח על העדר תאי גזע. לבסוף, מעקב שושלת-לקס cre אינו מאפשר כרגע המדידה עצמית והתחדשות. כדי להתחיל בהתמודדות טכנית הפער בתחום ביולוגיה של התא ובתאים הלבלב, המושבה 7-11 או organoid 12-15 </suמבחני p&gt; באמצעות מערכות תרבות 3D תוכננו. שני מבחני מושבה עבור אבות לבלב פותחו במעבדה שלנו: אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבוני מטריקס murine התאיים (ECM) (ראה שיטות וציוד טבלה), והשני מכיל הידרוג&#39;ל laminin, חלבון ECM מלאכותי מוגדר 7-11. ובתאים מעורבבים methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק. Methylcellulose הוא חומר אינרטי וצמיג ביולוגית מוכן סיבי עץ, ויש בו נעשה שימוש באופן שגרתי מבחני המושבה hematopoietic 16. את methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק מגביל את תנועתם של ובתאים יחידים, כך שהם לא יכולים מחדש המצרפי. עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תאים ובתאים לגדול להתמיין מושבה של תאים בחלל 3D. בהמשך למסורת של המטולוגים, תא ובתאים הלבלב כי היה מסוגל והוליד מושבה של תאים היה nאמד יחידת המושבה יוצרי הלבלב (PCFU). PCFUs, כאשר גדל ב assay המושבה ECM המכיל בעכברים, להצמיח מושבות פיברוזיס ששמם &quot;טבעת&quot; מושבות 7. עם תוספת של אגוניסט Wnt, R-spondin1, לתוך תרבות ECM המכיל בעכברים, כמה מושבות טבעת לההפך &quot;צפוף&quot; מושבות 7. במאמר זה, אלה שני סוגי מושבות הגדלים בתרבית ECM בעכברים הם יכונו &quot;טבעת / צפופות&quot; מושבות. כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבויות המכילות הידרוג&#39;ל laminin, &quot;האנדוקרינית / acinar&quot; מושבות נוצרות 7. שימוש יחיד מושבה ניתוחית, נמצא כי רוב מושבות טבעת / סמיך האנדוקרינית / acinar, או ממבוגר (2-4 בן חודש) 7,11 או צעיר (1 שבועות בן) 9 לבלב בעכברים, לבטא את כל השלושה סמני שושלת. הדבר מצביע על כך שרוב PCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. ב assay מושבת ECM המכיל בעכברים, PCFUs בעכברים הבוגר וחסון עצמי לחדש ולהרחיב כ -500,000 פעמים מעל 11 שבועות בתרבות 7. ECM Murine מועדף תומך התמיינות של תאים ductal על שושלות האנדוקרינית acinar, ואילו בנוכחות הידרוג&#39;ל laminin, PCFUs murine מעודדים להבדיל מועדף לתאי האנדוקרינית acinar ופחות אל שושלת ductal 7,9,11. חשוב לציין, אינסולין + גלוקגון - תאי-הורמונלית מונתה נוצר בתרבות הידרוג&#39;ל laminin ולהפריש אינסולין בתגובה לגלוקוז גירוי במבחנה 7,9, דבר המצביע על בגרות פונקציונלית. הבידול תלת-השושלת 7,9 פוטנציאל ההתחדשות עצמית 11 של PCFUs הבודד אושר על ידי המיקרומניפולציה תא בודד, כלומר, culturing תא אחד לכל טוב עבור היווצרות מושבה. יחד, תוצאות אלו מספקים ראיות שיש עצמית חידוש,-poten תלתt, דמויי תאים ובתאים בלבלב בעכברים לאחר הלידה המציגות פעילויות בתרבות 3D. מבחני PCFU murine המתואר במאמר זה לקוחים מתוך assay המושבה לפני המיועד ובתאים הבדיל מתאי גזע עובריים בעכברים (mESCs) 17. פרוטוקול זה מתועד בפירוט אחר פרסום יופיטר 18. הרכיבים וטכניקות התרבות נדרשו לבצע את assay מושבת ECM המכיל בעכברים עבור PCFUs המבוגר זהים עבור אבות נגזרות המסקלין 17,18. לכן, היבטים אלה של assay לא יחזור על עצמו כאן; במקום הנהלים הבאים יטופלו: 1) דיסוציאציה של הלבלב מבוגר ומיון תאים CD133 + Sox9 / EGFP + ductal, המעשירים PCFUs מעכברים בוגרים 7, 2) מניפולציה תא בודד של תאים ממוינים, 3)-מושבה אחת מנתח באמצעות qRT-PCR ו כל הר immunostaining, ו -4) דיסוציאציה של Colonie microfluidicים לתוך ההשעיה תא בודד מחדש ציפוי לתוך ECM בעכברים או מבחני המושבה הידרוג&#39;ל laminin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Hydrogel</td>
			<td>Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td>
			<td></td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Flacon Conical vial</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mmx20mm Suspension culture dish</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase1</td>
			<td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td>
			<td>11088831001</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101310</td>
			<td>low endotoxin, azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>400522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133-Biotin</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-1331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Allophycocyanin</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>3571</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mucin 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td>
			<td>HM-1630-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>127-495-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td>
			<td>101</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>0017-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T-4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40um Filter Mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um filter mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 96 Well Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924 (Previously 83.1835)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48.48 Dyanmic Array Chip</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>BMK-M-48.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>85000800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm petri dish with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Piece/ Rubber Tubing</td>
			<td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td>
			<td>MP-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin B</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>659-AB</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendin 4</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>E7144</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&#160;</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Black Well Plate</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flat, clear bottom with lid.&#160; Black polystyrene TC-treated microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD&#160;</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas

גזע ובתאים מהלבלב המבוגר יכולים להיות מקור פוטנציאלי של תאי בטא דמוי טיפולי לטיפול בחולי סוכרת מסוג 1. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם תאי גזע מולידם להתקיים בלבלב המבוגר. אסטרטגיות מחקר באמצעות-לקס cre שושלת-התחקות בעכברים בוגרים הניבו תוצאות כי גם תמיכה או להפריך את הרעיון כי תאי הבטא ניתן להפיק מן הצינורות, מיקומו המשוער שבו אבות לבלב מבוגרים עשויים להימצא. Vivo ב אלה שיטות cre-לקס התחקות השושלת, לעומת זאת, לא יכול לענות על השאלות של התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב השושלת צורך להגדיר תא גזע. כדי להתחיל פונה פער הטכני הזה, אנחנו ממציאים מבחני מושבה 3 ממדים עבור אבות לבלב. זמן קצר לאחר הפרסום הראשוני שלנו, מעבדות אחרות שפותחו באופן עצמאי דומה, אך לא זהה, שיטה המכונית assay organoid. בהשוואה assay organoid, השיטה שלנו מעסיקהmethylcellulose, המהווה פתרונות צמיגים המאפשרים הכללת החלבונים תאים מטריקס בריכוזים נמוכים. המבחנים המכיל methylcellulose להתיר זיהוי קל וניתוחים של ובתאים ברמת התא בודד, אשר הם קריטיים כאשר אבות מהווים אוכלוסייה-משנה קטן, כמו במקרה של תאי גזע איבר רבים מבוגר. יחד, תוצאות מכמה מעבדות להפגין במבחנת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאים דמויים לבלב מעכברים. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים שני מבחני מושבה מבוסס methylcellulose לאפיין אבות לבלב עכבר; אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבונים תאי מטריקס murine והשני חלבון תאי מטריקס מלאכותי המכונה הידרוג&#39;ל laminin. הטכניקות המוצגות כאן הן 1) דיסוציאציה של הלבלב ומיון של CD133 + Sox9 / EGFP + תאים ductal מעכברים בוגרים, 2) מניפולציה תא בודד של יםתאי orted, 3) מושבה אחת המנתח באמצעות immunostaining qRT-PCR ו כל ההר microfluidic, ו -4) דיסוציאציה של מושבות עיקריות לתוך תא בודד השעיות מחדש ציפוי לתוך מבחני מושבה משני להעריך התחדשות עצמית או בידול.

ניתן להעשיר תאי בוגרים ובתאי לבלב על ידי מיון תא מופעל קרינה (איור 1). שורת העכבר המהונדס Sox9 / EGFP משמשת כאן נוצרה הראשונה כתוצאה של פרויקט אטלס מוח GENSAT 19, ואת כתב EGFP נמצא תחת השליטה של כרומוזום חיידקים מלאכותי המכיל ~ 75 kb במעלה או ~ 150 kb רצפ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...