Name: in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

Ringraziamo Lucy Brown e Alexander Spalla dalla Analytical Citometria core a Città della Speranza per l&#39;assistenza nella selezione. Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01DK081587 e R01DK099734 per HTK e U01DK089533 di ADR, e dalla National Science Foundation concessione NSF-DMR-1.206.121 e California Institute for Regenerative Medicine concessione RB5-07398 a DAT Supporti dal Joseph J. Jacobs Istituto di Ingegneria molecolare per la Medicina al Caltech di DAT, e quelli da Oxnard Foundation e Ella Fitzgerald Foundation per HTK sono anche riconosciuto con gratitudine. Finanziamento: Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 per HTK e U01DK089533 di ADR, e dalla National Science Foundation concessione NSF-DMR-1.206.121 e California Institute for Regenerative Medicine concessione RB5-07398 a DAT supporta da Joseph J. JacobsIstituto di Ingegneria Molecolare per la Medicina al Caltech di DAT, e quelli da Oxnard Foundation e Ella Fitzgerald Foundation per HTK sono anche ringraziano. La ricerca riportato nella presente pubblicazione incluso lavoro svolto nel Analitica citometria Core e microscopia ottica Digital Imaging Nucleo sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health con il numero premio P30CA33572. Sponsor dello studio: Lo sponsor non ha partecipato allo studio di progettazione, la raccolta, l&#39;analisi, o l&#39;interpretazione dei dati.

Dichiarazione etica: Aderiamo agli standard etici ampiamente accettati nel condurre ricerche per garantire la qualità e l&#39;integrità dei risultati. La sperimentazione animale è condotto secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa al City of Hope. 1. Preparare cella singola sospensione da adulti Murine pancreata NOTA: Nelle pubblicazioni precedenti 7,11, sono stati utilizzati topi CD-1 o di sfondo B6; entrambi gli sfondi dato risultati simili. Una ...

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	<li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis.">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>DiGiusto, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem/progenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium.">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation.">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting.">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li><li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice.">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li><li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss.">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li></ol>

I saggi colonia pancreatiche e singola colonia analisi qui descritti sono stati ispirati dai saggi delle colonie ematopoietiche metilcellulosa contenenti che hanno giocato un ruolo importante nel decifrare la biologia delle cellule progenitrici ematopoietiche nei decenni passati 23. In questi test (Figura 5), dissociate cellule del pancreas sono placcati in metilcellulosa contenenti supporti semi-solido con fattori di crescita appropriati e proteine ​​ECM che sostengono la formazione di a...

Il pancreas è composto da tre principali linee cellulari; cellule acinose secernono enzimi digestivi, condotti secernere mucina per respingere gli agenti patogeni e il trasporto di enzimi digestivi per l&#39;intestino e le cellule endocrine secernono ormoni, tra cui l&#39;insulina e il glucagone, che mantengono l&#39;omeostasi del glucosio. Durante lo sviluppo embrionale del pancreas, i primi cellule duttali sono la fonte delle cellule progenitrici tri-potenti in grado di dare origine a tre linee nel pancreas di animali adulti 1,2. Poiché le cellule staminali e progenitrici adulte, come le cellule staminali del midollo osseo, sono già utilizzati con successo per il trattamento di varie malattie 3, vi è intenso interesse nel trovare le cellule staminali e progenitrici nel pancreas adulto. Se l&#39;isolamento e la manipolazione delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche adulte erano possibili, queste cellule potrebbero essere utilizzate per il trattamento di malattie come il diabete di tipo 1, in cui le cellule che secernono insulina vengono distrutte da autoimmunità. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Sia che ancora esistono cellule progenitrici tri-potenti in dotti pancreatici adulti dopo il completamento dello sviluppo embrionale è una domanda che è fortemente dibattuto nella comunità scientifica. In questo dibattito, e l&#39;utilizzo in vivo cre-lox lineage tracing tecniche, Inada e colleghi hanno dimostrato che le cellule adulte duttale murine etichettati con un pennarello, carbonica II, potrebbero dare origine a tutte e tre le linee del pancreas 4. Tuttavia, utilizzando altri marcatori duttali, come HNF1B era 5 e Sox9 2, si è concluso che le cellule duttali non sono la principale fonte di cellule beta topi adulti. Molti anni fa, abbiamo proposto che la causa della discussione suddetto può essere dovuto alla mancanza, nel campo 6,7, di strumenti analitici adeguati che possono essere utilizzati per misurare auto-rinnovamento e multi-lineage differenziazione-due criteri necessario definire una cellula staminale. L&#39;in vivo cre-lox tecnica lineage tracing menzionatosopra può fornire prove per la relazione progenitore-progenie a livello di popolazione. Tuttavia, questa tecnica tracciando lignaggio è limitata nel suo potere di discernere se le cellule progenitrici singoli possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in molteplici linee. analisi singola cella è importante perché se diversi progenitori mono-potente, ognuno con un diverso potenziale stirpe, sono stati analizzati insieme, possono apparire collettivamente avere multi-lignaggio capacità di differenziazione. Inoltre, le cellule staminali sono di solito una frazione minore di un organo adulto. Le attività di una popolazione di cellule minore potrebbe essere mascherati dalla popolazione principale. Pertanto, un risultato negativo da uno studio di popolazione non indica necessariamente l&#39;assenza di cellule staminali. Infine, cre-lox lignaggio tracciamento attualmente non consentono di misurare la auto-rinnovamento. Per iniziare affrontando il divario tecnico nel campo della biologia delle cellule progenitrici del pancreas, colonia 7-11 o 12-15 organoide </sup&gt; saggi che utilizzano sistemi di coltura 3D sono state elaborate. Due saggi di colonia per progenitori pancreatici sono stati sviluppati nel nostro laboratorio: uno contiene una preparazione commerciale di proteine ​​murine matrice extracellulare (ECM) (vedere Metodi e Impianti Table), e l&#39;altra contiene idrogel laminina, un definito ECM proteina artificiale 7-11. cellule progenitrici sono mescolati in mezzo semisolido contenente metilcellulosa. Metilcellulosa è un materiale biologicamente inerte e viscosa preparato da fibre di legno, ed è stato utilizzato di routine in saggi colonie ematopoietiche 16. La metilcellulosa contenente mezzo semisolido limita il movimento delle cellule progenitrici singoli in modo che non può ri-aggregate. Tuttavia, il mezzo è abbastanza morbida da consentire una cellula progenitrice di crescere e differenziarsi in una colonia di cellule nello spazio 3D. Seguendo la tradizione degli ematologi, una cellula progenitrice del pancreas che è stato in grado di dare origine a una colonia di cellule era named una unità formanti colonie pancreatica (PCFU). PCFUs, quando coltivate nel saggio colonia ECM contenenti murino, danno origine a colonie cistica che sono denominati &quot;Ring&quot; colonie 7. L &#39;aggiunta di un agonista Wnt, R-spondin1, nella cultura murino ECM-contenente, alcune colonie Anello trasformano in colonie &quot;dense&quot; 7. In questo articolo, questi due tipi di colonie cresciute in coltura ECM murino sono indicate collettivamente come colonie &quot;Ring / dense&quot;. Quando anello colonie / dense sono dissociate in sospensione di cellule singole e ri-placcato in culture che contengono laminina idrogel, colonie &quot;Endocrine / acinari&quot; si formano 7. Utilizzando singola colonia analisi, si è constatato che la maggior parte delle colonie Ring / densi e Endocrino / acinari, sia da adulto (2-4 mesi) 7,11 o giovani (1 settimane di età) 9 pancreas di topo, esprimono tutti e tre marcatori lignaggio. Questo suggerisce che la maggior parte delle PCFUs originari sono tri-potenti. Nel saggio colonia ECM contenenti murino, adulto PCFUs murino robusta auto-rinnovarsi e di espandere di circa 500.000 volte più di 11 settimane nella cultura 7. ECM murino supporta preferenzialmente la differenziazione delle cellule duttali oltre endocrine e acinose lignaggi, mentre in presenza di laminina idrogel, PCFUs murini sono incoraggiati a differenziarsi preferenzialmente in cellule endocrine e acinose e meno al duttale stirpe 7,9,11. È importante sottolineare che, insulina + glucagone - celle mono-ormonale sono generati nella cultura idrogel laminina e secernere insulina in risposta al glucosio stimolazione in vitro 7,9, suggerendo la maturità funzionale. La differenziazione tri-lignaggio potenziale 7,9 e di auto-rinnovamento 11 dei singoli PCFUs sono confermate da micromanipolazione cella singola, vale a dire, la coltura di una cella per bene per la formazione di colonie. Insieme, questi risultati forniscono la prova che ci sono auto-rinnovamento, tri-potent, cellule progenitrici simili nel pancreas murino postnatale che mostrano le attività in coltura 3D. I saggi PCFU murini descritti in questo articolo sono derivati ​​da un test colonia prima progettata per le cellule progenitrici differenziate da cellule murine embrionali staminali (mESCs) 17. Questo protocollo è documentato in dettaglio in un&#39;altra pubblicazione JoVE 18. I componenti e le tecniche necessarie per eseguire il test colonia ECM contenenti murino per PCFUs adulti cultura sono gli stessi di progenitori Mesc-derivati ​​17,18. Pertanto, questi aspetti del test non saranno ripetute qui; invece saranno affrontate le seguenti procedure: 1) la dissociazione del pancreas adulti e ordinamento / EGFP + cellule duttali CD133 + SOX9, che arricchiscono PCFUs da topi adulti 7, 2) la manipolazione cella singola delle cellule ordinati, 3) single-colonia analisi usando microfluidica qRT-PCR e tutto il montaggio immunostaining, e 4) la dissociazione di Colonies in cella singola sospensione e ri-placcatura in ECM murino o laminina saggi di idrogel colonia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Hydrogel</td>
			<td>Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td>
			<td></td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Flacon Conical vial</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mmx20mm Suspension culture dish</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase1</td>
			<td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td>
			<td>11088831001</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101310</td>
			<td>low endotoxin, azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>400522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133-Biotin</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-1331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Allophycocyanin</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>3571</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mucin 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td>
			<td>HM-1630-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>127-495-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td>
			<td>101</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>0017-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T-4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40um Filter Mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um filter mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 96 Well Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924 (Previously 83.1835)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48.48 Dyanmic Array Chip</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>BMK-M-48.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>85000800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm petri dish with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Piece/ Rubber Tubing</td>
			<td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td>
			<td>MP-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin B</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>659-AB</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendin 4</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>E7144</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&#160;</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Black Well Plate</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flat, clear bottom with lid.&#160; Black polystyrene TC-treated microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD&#160;</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas

Staminali e cellule progenitrici da parte del pancreas adulti potrebbero essere una potenziale fonte di cellule beta-come terapeutici per il trattamento di pazienti affetti da diabete di tipo 1. Tuttavia, non è ancora noto se le cellule staminali e progenitrici esistono nel pancreas adulto. strategie di ricerca utilizzando cre-lox lineage tracing in topi adulti hanno dato risultati che sostenere o confutare l&#39;idea che le cellule beta possono essere generati dai condotti, il luogo in cui si presume adulte progenitrici del pancreas possono risiedere. Questi metodi lineage tracing in vivo cre-LOX, tuttavia, non possono rispondere alle domande di auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione-due criteri necessari per definire una cellula staminale. Per iniziare affrontare questa lacuna tecnica, abbiamo ideato saggi di colonia 3-dimensionali per progenitori pancreatici. Poco dopo la nostra pubblicazione iniziale, altri laboratori hanno sviluppato in modo indipendente una simile, ma non identica, metodo chiamato il test organoide. Rispetto al dosaggio organoide, il nostro metodo impiegametilcellulosa, che forma soluzioni viscose che consentono l&#39;inserimento di proteine ​​della matrice extracellulare a basse concentrazioni. I saggi metilcellulosa contenenti consentono una facile individuazione e analisi di cellule progenitrici a livello di singola cellula, che sono fondamentali quando progenitori costituiscono una piccola sotto-popolazione, come è il caso per molti cellule staminali adulte di organi. Insieme, i risultati di diversi laboratori dimostrano in vitro auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione delle cellule progenitrici simili pancreatiche da topi. I protocolli attuali descrivono due saggi di colonia metilcellulosa-based per caratterizzare i progenitori del mouse del pancreas; uno contiene una preparazione commerciale di proteine ​​della matrice extracellulare murine e l&#39;altra una proteina della matrice extracellulare artificiale conosciuto come un idrogel laminina. Le tecniche qui riportate sono 1) la dissociazione del pancreas e smistamento di CD133 + Sox9 / EGFP + cellule duttali da topi adulti, 2) la manipolazione singola cellula dei scellule orted, 3) singola colonia analisi utilizzando microfluidica qRT-PCR e tutto il montaggio immunostaining, e 4) la dissociazione di colonie primarie in cella singola sospensioni e ri-placcatura in saggi di colonia secondari per valutare il self-renewal o differenziazione.

Adulti cellule progenitrici del pancreas possono essere arricchiti mediante fluorescenza-attivato cell sorting (Figura 1). La linea di topi transgenici Sox9 / EGFP usato qui è stato generato a seguito del GENSAT Cervello Atlas Progetto 19, e il reporter EGFP è sotto il controllo di un cromosoma artificiale batterico contenente ~ 75 kb a monte e ~ 150 KB sequenze a valle di Sox9 20 . In questi topi, EGFP etichette dotti pancreatici in modo efficien...

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In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

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Produzione e l&#39;uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi mielinizzazione

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

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Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

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The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

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This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

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In tempo reale Live-cella flusso Cytometry per indagare l'afflusso del calcio, la formazione del poro e fagocitosi dai recettori P2X7 in cellule progenitrici neurali adulto

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

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Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

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