Name: in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

Vi takker Lucy Brown og Alexander Spalla fra Analytical Cytometry Kjerne på City of Hope for å få hjelp i sortering. Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) innvilger R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og ved National Science Foundation tilskudd NSF-DMR-1206121 og California Institute for Regenerative Medicine stipend RB5-07398 til DAT Støtter fra Joseph J. Jacobs Institute for Molecular Engineering for medisin ved Caltech til DAT, og de fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også takknemlig erkjent. Finansiering: Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) gir R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og ved National Science Foundation tilskudd NSF-DMR-1206121 og California Institute for Regenerative Medicine stipend RB5-07398 til DAT Støtter fra Joseph J. JacobsInstitutt for molekylær Engineering for medisin ved Caltech til DAT, og de fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også takknemlig erkjent. Forskning rapportert i denne publikasjonen inkludert arbeid utført i Analytical Cytometry Core og lysmikroskopi Digital Imaging Core støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold award nummer P30CA33572. Study sponsor: Sponsoren deltok ikke i studien design, innsamling, analyse, eller tolkning av data.

Etisk Uttalelse: Vi holder oss til de allment aksepterte etiske standarder i å drive forskning for å sikre kvalitet og integritet av resultatene. Dyreforsøk er gjennomført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité på City of Hope. 1. Forbered Single-celle Suspensjon fra Adult Murine pankreata MERK: I tidligere publikasjoner 7,11, ble CD-en eller B6 bakgrunns mus som brukes; begge bakgrunn ga lignende resultater. En transgen muselinje (betegnet Sox9 / EG...

<ol>
	<li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis.">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34(+)+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma.">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li><li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth.">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li><li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth.">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation.">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li><li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct,+Acinar,+and+Endocrine+Cells+In+Vitro.">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures.">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl/6+Mice.">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells.">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940 (2013).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar.">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li><li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin,+the+ligand+for+the+Mpl+receptor,+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice.">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li><li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors.">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148 (2011).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem/progenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium.">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation.">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting.">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li><li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice.">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li><li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss.">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li></ol>

Pancreatic koloni analyser og enkelt koloni analyser beskrevet her ble inspirert av metylcellulose holdige blodkreft koloni analyser som har spilt viktige roller i å tyde biologi blodkreft stamceller i de siste tiårene 23. I disse analyser (figur 5), dissosiert pankreatiske celler blir sådd ut i metylcellulose inneholdende halvfaste medier med passende vekstfaktorer og ECM proteiner som fremmer dannelsen av Ring, tett eller endokrine / acinar kolonier 7. En enkelt stamceller som...

Bukspyttkjertelen er sammensatt av tre hovedcelle linjer; acinar cellene skiller ut fordøyelsesenzymer, kanaler skiller ut mucin å avverge patogener og transportere fordøyelsesenzymer til tarmen, og endokrine cellene skiller ut hormoner, inkludert insulin og glukagon, som opprettholder glukose homeostase. I løpet av den embryoniske utviklingen av bukspyttkjertelen, de tidlige ductal cellene er kilden for tri-potent stamceller som er i stand til å gi opphav til de tre linjene i pankreata av voksne dyr 1,2. Ettersom voksne stamceller og forløperceller, slik som benmarg stamceller, er allerede med hell anvendes for å behandle ulike sykdommer 3, er det stor interesse i å finne de stamceller og forløperceller i den voksne bukspyttkjertelen. Ved isolering og manipulering av voksne bukspyttkjertelen stilk og stamceller var mulig, kan disse cellene bli brukt til behandling av sykdommer så som type 1-diabetes, hvor de insulinsekreterende cellene blir ødelagt av autoimmunitet. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Enten tri-potent stamceller fremdeles eksisterer hos voksne bukspyttkjertelen kanaler etter ferdigstillelse av embryoutvikling er et spørsmål som er sterkt debattert i det vitenskapelige miljøet. I denne debatten, og ved hjelp av in vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikker, Inada og medarbeidere viste at voksne murine duktale celler merket med en markør, karboanhydrase II, kan gi opphav til alle tre bukspyttkjertelen linjene 4. Men ved å bruke andre duktale markører, for eksempel HNF1b 5 og Sox9 2, ble det konkludert med at ductal celler er ikke den viktigste kilden til beta-cellene i voksen mus. For flere år siden foreslo vi at årsaken til den foran nevnte debatt kan skyldes mangel, innen 6,7, av hensiktsmessige analytiske verktøy som kan brukes til å måle selvfornyelse og multilineær differensierings to kriterier er nødvendig for å definere en stamcelle. In vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikk nevntovenfor kan gi bevis for stamfar-avkom forhold på befolkningsnivå. Imidlertid er denne linjen tracing teknikk begrenset i sin makt for å avgjøre om enkelt stamceller kan fornye seg selv og skille ut flere linjene. Encellede analyse er viktig fordi hvis flere mono-potent stamfedre, hver med en annen avstamning potensial, ble analysert sammen, kan de kollektivt synes å ha multi-avstamning differensiering evner. I tillegg stamceller er vanligvis en mindre populasjon av en voksen organ. Virksomheten til en mindre celle befolkning kan bli maskert av den store befolkningen. Derfor ikke et negativt resultat fra en befolkningsundersøkelse ikke nødvendigvis indikerer fravær av stamceller. Til slutt, ikke cre-lox avstamning tracing for øyeblikket ikke at måling av selvfornyelse. For å begynne å ta opp teknisk gap i feltet av pankreas stamcellebiologi, koloni 7-11 eller 12-15 organoid </sup&gt; analyser ved hjelp av 3D-kultur systemene ble utviklet. To koloni-analyser for pankreas progenitorceller ble utviklet i vårt laboratorium: en inneholder en kommersiell fremstilling av murine ekstracellulære matriksproteiner (ECM) (se metoder og utstyr tabell), og den andre inneholder laminin hydrogel, en definert kunstig ECM protein 7-11. Stamceller blandes i halvfast medium inneholdende metylcellulose. Methylcellulose er et biologisk inert og tyktflytende materiale fremstilt av trefibre, og har blitt rutinemessig brukt i blodkreft koloni analyser 16. Den metylcellulose inneholdende halvfast medium begrenser bevegelsen av enkelt stamceller, slik at de ikke kan re-aggregat. Likevel er det medium myk nok til å tillate en stamceller til å vokse og differensiere til en koloni av celler i 3D-rommet. Etter tradisjonen av Hematologer, en bukspyttkjertelen stamceller som var i stand til å gi opphav til en koloni av celler var named en pankreatisk kolonidannende enhet (PCFU). PCFUs, når dyrket i murine ECM-holdige koloni analysen, gir opphav til cystisk kolonier som er navngitt &quot;ring&quot; kolonier 7. Ved tilsetning av en Wnt agonist, R-spondin1, inn i murine ECM-holdige kultur, noen Ring koloniene slå inn &quot;Tett&quot; kolonier 7. I denne artikkelen, er disse to typer av kolonier dyrket i murine ECM kultur kollektivt referert til som &quot;Ring / tette&quot; kolonier. Når ring / tette kolonier er dissosiert til enkelt celle suspensjon og re-belagt i kulturer som inneholder laminin hydrogel, &quot;Endocrine / acinar&quot; kolonier dannes 7. Ved hjelp av enkelt koloni analyser, ble det funnet at flertallet av Ring / Tette og endokrine / acinar kolonier, enten fra voksen (2-4 måneder gamle) 7,11 eller ung (1 uke gammel) 9 murine bukspyttkjertelen, uttrykke alle tre Lineage markører. Dette tyder på at de fleste av de som kommer PCFUs er tri-potent. I murine ECM-holdige koloni analysen, voksen murine PCFUs robust selv fornye og utvide ca 500.000 ganger i løpet av 11 uker i kultur 7. Murine ECM støtter fortrinnsvis differensieringen av celler ductal enn endokrine og acinar linjene, mens i nærvær av laminin hydrogel, er murine PCFUs oppfordres til å differensiere preferensielt inn i endokrine og akinærceller og i mindre grad til den duktal avstamning 7,9,11. Viktigere, Insulin Glucagon + - mono-hormonelle celler blir generert i laminin hydrogel kulturen og utskiller insulin som svar på glukose stimulering in vitro 7,9, noe som tyder på funksjonell modenhet. Tri-avstamning differensiering potensial 7,9 og selvfornyelse 11 av individuelle PCFUs er bekreftet av encellede micromanipulation, dvs. dyrking av en celle per brønn for kolonidannelse. Sammen utgjør disse resultatene gir bevis for at det er selvfornyende, tri-pot, progenitor-lignende celler i postnatal murine bukspyttkjertelen som viser aktiviteter i 3D kultur. De murine PCFU analysene beskrevet i denne artikkelen er hentet fra en tidligere koloni analysen designet for stamceller differensiert fra murine embryonale stamceller (mESCs) 17. At protokollen er dokumentert i detalj i en annen Jove publikasjon 18. Kultur komponenter og teknikker som er nødvendige for å utføre den murine ECM-inneholdende koloni assay for et voksent PCFUs er de samme som for Mesc-avledede stamceller 17,18. Derfor vil disse aspektene av analysen ikke bli gjentatt her; i stedet følgende prosedyrer vil bli tatt opp: 1) dissosiasjon av den voksne bukspyttkjertelen og sortering CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler, som beriker PCFUs fra voksen mus 7, 2) encellede manipulering av de sorterte celler, 3) single-koloni analyser ved hjelp microfluidic QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av Colonies inn enkeltcellesuspensjon og re-plating inn murine ECM eller laminin hydrogel koloni analyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Hydrogel</td>
			<td>Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td>
			<td></td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Flacon Conical vial</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mmx20mm Suspension culture dish</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase1</td>
			<td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td>
			<td>11088831001</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101310</td>
			<td>low endotoxin, azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>400522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133-Biotin</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-1331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Allophycocyanin</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>3571</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mucin 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td>
			<td>HM-1630-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>127-495-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td>
			<td>101</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>0017-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T-4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40um Filter Mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um filter mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 96 Well Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924 (Previously 83.1835)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48.48 Dyanmic Array Chip</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>BMK-M-48.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>85000800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm petri dish with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Piece/ Rubber Tubing</td>
			<td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td>
			<td>MP-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin B</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>659-AB</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendin 4</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>E7144</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&#160;</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Black Well Plate</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flat, clear bottom with lid.&#160; Black polystyrene TC-treated microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD&#160;</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas

Stilk og progenitorceller fra den voksne bukspyttkjertelen kan være en potensiell kilde for terapeutiske beta-lignende celler for behandling av pasienter med type 1 diabetes. Det er imidlertid fremdeles ukjent hvorvidt stamceller og forløperceller eksisterer i den voksne bukspyttkjertelen. Forskningsstrategier ved hjelp av CRE-lox avstamning-sporing i voksne mus har gitt resultater som enten støtte eller avkrefte ideen om at beta-cellene kan genereres fra kanalene, den antatte stedet der voksne bukspyttkjertelen stamfedre kan ligge. Disse in vivo CRE-lox avstamning-sporing metoder, men kan ikke svare på spørsmål om selvfornyelse og multi-avstamning differensiering-to kriterier som er nødvendige for å definere en stamcelle. For å begynne å ta opp dette tekniske gap, utviklet vi tre-dimensjonale koloni analyser for bukspyttkjertelen stamfedre. Snart etter vår første utgivelse, andre laboratorier uavhengig utviklet en lignende, men ikke identisk, metode kalt organoid analysen. Sammenlignet med organoid analysen, benytter vår metodemetylcellulose, som danner viskøse løsninger som tillater inkludering av ekstracellulære matriksproteiner ved lave konsentrasjoner. De metylcellulose inneholder analyser tillate enklere gjenkjenning og analyser av stamceller ved encellede nivå, som er kritisk når stamfedre utgjør en liten sub-populasjon, slik tilfellet er for mange voksne organ stamceller. Sammen Resultatene fra flere laboratorier demonstrere in vitro selvfornyelse og multilineær differensiering av progenitorceller pankreas-liknende celler fra mus. De nåværende protokoller beskriver to metylcellulose baserte koloni analyser for å karakterisere mus bukspyttkjertelen stamfedre; en inneholder en kommersiell fremstilling av murine ekstracellulære matriksproteiner og den andre en kunstig ekstracellulære matriks-protein kjent som en laminin hydrogel. Teknikkene som vises her er 1) dissosiasjon i bukspyttkjertelen og sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler fra voksne mus, 2) enkelt celle manipulering av sunderstøttes celler, 3) enkelt koloni analyser ved hjelp av mikrofluid QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av primære kolonier i encellede suspensjoner og re-plating i videregående koloni analyser for å vurdere selvfornyelse eller differensiering.

Voksen bukspyttkjertelen stamceller kan bli beriket av fluorescens-aktivert celle sortering (figur 1). Den Sox9 / EGFP transgen muselinje som brukes her først ble generert som et resultat av den GENSAT Brain Atlas Prosjekt 19, og den EGFP reporteren er under kontroll av et bakterielt kunstig kromosom inneholdende ~ 75 kb oppstrøms og ~ 150 kb nedstrøms-sekvensene i Sox9 20 . I disse musene, etiketter EGFP pancreatic kanaler effektivt og spesielt ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro koloni analyser for å avdekke selvfornyelse og differensiering av stamceller isolert fra voksne murine bukspyttkjertelen er utviklet. I disse assays, pankreas forløpere gir opphav til cellekolonier i tre-dimensjonalt rom i metylcellulose inneholdende halvfast medium. Protokoller for håndtering av enkeltceller og karakterisering av individuelle kolonier er beskrevet.

In Vitro Colony analyser for å karakterisere Tri-potente stamceller isolert fra den voksne Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; myelination Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em&gt; I Vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolere Mesangiogenic stamceller (MPCS) fra human benmarg

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hele-celle Patch-clamp Opptak av isolerte primære epitelceller fra epididymene

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoksisk forbehandling av margenavledede progenitorceller som kilde for generering av modne Schwann-celler

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Sanntid Live-celle flowcytometri å undersøke kalsium tilstrømningen Pore dannelse og fagocytose av P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...