Name: in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

Biz sıralama yardım için Umut City Analitik Sitometri Çekirdek Lucy Brown ve Alexander spalla teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık (NIH) National Institutes DAT Destekler için Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından R01DK081587 ve R01DK099734 HTK için, ve ADR U01DK089533 ve hibe kısmen desteklenen HTK Oxnard Vakfı ve Ella Fitzgerald Vakfı Joseph J. Jacobs DAT Caltech&#39;te Tıp Moleküler Mühendislik Enstitüsü, ve olanlardan minnetle kabul de bulunmaktadır. Finansman: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen HTK için R01DK081587 ve R01DK099734 verir ve ADR U01DK089533, ve Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından DAT Joseph J. Jacobs desteklerDAT Caltech&#39;te Tıp Moleküler Mühendisliği Enstitüsü ve Oxnard&#39;ın Vakfı ve HTK için Ella Fitzgerald Vakfı olanlar da şükranla kabul edilmektedir. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası P30CA33572 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Analitik Sitometri Çekirdek ve Işık Mikroskopi Dijital Görüntüleme Core yapılan çalışmaları yer alıyor. Çalışma sponsoru: Sponsor verilerinin çalışma tasarımı, toplama, analiz, ya da yorumlanması katılmadı.

Etik Açıklama: Biz kalite ve sonuçların bütünlüğünü sağlamak için araştırma yaygın olarak kabul gören etik standartlara uygun. Hayvan deneyleri Umut City Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre yapılır. 1. Yetişkin Fare pancreata gelen Tek hücreli Süspansiyon Hazırlamak NOT: Önceki yayınlarda 7,11, CD-1 veya B6 arka plan fareler kullanıldı; Her iki arka benzer sonuçlar vermiştir. SOX9 loci 19,20 tarafınd...

<ol>
	<li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis.">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34(+)+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma.">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li><li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth.">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li><li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth.">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation.">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li><li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct,+Acinar,+and+Endocrine+Cells+In+Vitro.">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures.">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl/6+Mice.">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells.">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940 (2013).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar.">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li><li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin,+the+ligand+for+the+Mpl+receptor,+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice.">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li><li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors.">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148 (2011).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem/progenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium.">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation.">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting.">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li><li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice.">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li><li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss.">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li></ol>

Pankreas koloni deneyleri ve tek bir koloni burada açıklanan analizleri geçmiş yıllarda 23 hematopoetik progenitör hücrelerin biyolojisi çözmekte önemli roller oynamışlardır metilselüloz içeren hematopoetik koloni deneyleri ilham edildi. Bu analizlerde (Şekil 5), pankreas hücreleri içinde plakalanır ayrışmış metil-içeren halka, yoğun ya da endokrin / Asiner koloniler 7 oluşumunu destekleyen uygun büyüme faktörleri ve ECM proteinleri ile yarı-katı orta...

Pankreas üç ana hücre soylarının oluşmaktadır; asiner hücreler sindirim enzimleri, kanallar patojenleri savuşturmak ve bağırsak sindirim enzimleri taşımak için müsin salgılayan salgıladıkları ve endokrin hücreleri glikoz homeostazını korumak insülin ve glukagon da dahil olmak üzere hormonlar, salgılar. Pankreasın embriyonik gelişim sırasında, erken duktal hücreler yetişkin hayvanların 1,2 pancreata üç soy sebebiyet veren yeteneğine sahip tri-güçlü progenitör hücrelerin kaynağıdır. Kemik iliği kök hücreleri olarak yetişkin kök ve progenitör hücreler, zaten başarıyla çeşitli hastalıkların 3 tedavi etmek için kullanılır, çünkü yetişkin pankreas kök ve progenitör hücreler bulmakta yoğun ilgi var. yalıtım ve yetişkin pankreas kök ve projenitör hücrelerin manipülasyonu mümkün olsaydı, bu hücrelerin insülin salgılayan hücreleri otoimmün tahrip edildiği tip 1 diyabet gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; embriyonik gelişiminin tamamlanması yoğun bilim dünyasında tartışılan bir sorudur sonra tri-güçlü progenitör hücrelerin hala yetişkin pankreas kanallarında var olsun. Bu tartışmada, ve kullanma in vivo CRE-lox soy-izleme teknikleri, inada ve arkadaşları bir belirteç, karbonik anhidraz II ile etiketlenmiş erişkin fare duktal hücreler, her üç pankreas soy 4 yol olabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu HNF1b 5 ve SOX9 2 gibi diğer duktal belirteçleri kullanarak, bu kanal sayısı, yetişkin farelerde p hücrelerinin önemli bir yöntem değildir sonucuna varılmıştır. Birkaç yıl önce, biz yukarıda belirtilen tartışmanın nedeni gerekli kendini yenileme ve çok soy farklılaşma-iki kriter ölçmek için kullanılabilecek uygun analitik araçlar, bu alanda 6,7, eksikliği nedeniyle olabilir önerdi bir kök hücre tanımlamak. Söz in vivo CRE-lox soy-tracing tekniğiYukarıdaki nüfus düzeyinde progenitör-döl ilişki için kanıt sağlayabilir. Ancak, bu soy izleme tekniği tek progenitör hücrelerin kendini yenilemesi ve birden fazla soy içine ayırt edip edemeyeceğini ayırt elinden sınırlıdır. Birkaç mono-güçlü ataları, farklı bir soy potansiyeline sahip her birlikte analiz edildi, onlar topluca çok soyundan farklılaşma yeteneklerine sahip görünebilir, çünkü Tek hücre analizi önemlidir. Buna ek olarak, kök hücreler, genellikle yetişkin bir organın küçük bir gruptur. küçük bir hücre popülasyonu faaliyetleri büyük nüfus tarafından maskeli olabilir. Bu nedenle, nüfus çalışmanın bir negatif sonuç mutlaka kök hücrelerin yokluğunu göstermez. Son olarak, CRE-lox soy izleme şu anda kendini yenileme ölçümünü izin vermez. Pankreatik progenitör hücre biyolojisi, koloninin alanında teknik boşluğu ele başlamak için 7-11 veya organoid 12-15 </su3D kültür sistemi kullanılarak p&gt; deneyleri icat edildi. Pankreas atalarıdır için iki koloni deneyleri laboratuvarda geliştirilmiştir: bir kemirgen hücre dışı matriks proteinleri (ECM) (Yöntemler ve Ekipmanları Tabloya bakınız) ticari bir hazırlık içerir ve diğer laminin hidrojel, tanımlanmış bir yapay ECM protein 7-11 içerir. Progenitör hücreler, yan-katı ortam içeren metilselüloz karıştırılır. Metilselüloz ağaç liflerinden hazırlanan biyolojik olarak eylemsiz ve yapışkan bir malzemedir ve rutin olarak hematopoietik koloni deneylerinde 16 kullanılmıştır. bunlar yeniden toplanamamış- böylece metilselüloz içeren yan-katı ortam bir progenitör hücrelerin hareketi kısıtlar. Bununla birlikte, ortam bir progenitör hücre büyümesi ve 3D uzayda bir hücre kolonisi ayırt izin verecek kadar yumuşaktır. hematolog geleneğini izleyerek, hücrelerin bir koloni sebebiyet veren yapabileceğini bir pankreatik progenitör hücre n olduamed pankreas koloni oluşturan birimi (PCFU). Fare ECM içeren koloni tahlilinde yetiştirilen PCFUs, &quot;Halka&quot; koloniler 7 adlandırılır kistik koloniler meydana getirirler. Wnt agonistinin eklenmesi üzerine, R spondin1, kemirgen ECM içeren kültürü bazı halkası koloniler &quot;yoğun&quot; koloniler 7 çevrilir. Bu makalede, fare ECM kültüründe yetişen koloniler bu iki tür toplu olarak &quot;Halka / Yoğun&quot; koloniler olarak adlandırılır. Yüzük / Yoğun koloniler tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış ve laminin hidrojel ihtiva kültürlere yeniden kaplama zaman, &quot;Endokrin / Asiner&quot; koloniler 7 oluşturulmaktadır. Tek bir koloni analizleri kullanarak, 9 sıçan pankreas, ya yetişkin dan (2-4 aylık) 7,11 ya da genç (1 haftalık) Yüzük / Yoğun ve Endokrin / Asiner kolonilerinin çoğunluğu, üçünü ifade olduğu tespit edilmiştir soy belirteçleri. Bu menşe PCFUs en tri-güçlü olduğunu göstermektedir. Fare ECM içeren koloni deneyde, yetişkin fare PCFUs sağlam kendini yenilemek ve kültür 7 11 hafta boyunca yaklaşık 500.000 kez genişletin. Laminin hidrojel mevcudiyetinde, sıçangil PCFUs endokrin ve asinar hücreleri içine, tercihen ayırt etmek için teşvik duktal soy 7,9,11 çok az oysa sıçangil ECM tercihan, endokrin ve asinar soyları duktal hücrelerin farklılaşmasını destekler. Önemli olarak, insülin + Glukagon - mono- hormon hücreleri laminin hidrojel kültürde üretilir ve fonksiyonel olgunlaşmasına gösteren in vitro 7,9 bölgesindeki Glükoz uyarısına karşı tepki olarak insülin salgılar edilir. 7,9 olası üç dizi farklılaşma ve bireysel PCFUs kendini yenileme 11 koloni oluşumu için oyuk başına bir hücrenin kültürlenmesini, tek hücreli mikromanipülasyon örneğin tarafından teyit edilir. Birlikte, bu sonuçlar kendini yenileyen, tri-Poten olduğunu kanıtlar sunmaktadırt, 3D kültür faaliyetleri göstermek doğum sonrası fare pankreas progenitör benzeri hücreler. Bu makalede açıklanan sıçangil PCFU tahlilleri fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) 17 ile ayırt progenitör hücreler için tasarlanmış önceki koloni deneyi türetilir. Bu protokol başka vallahi yayında 18&#39;de detaylı olarak belgelenmiştir. Kültür bileşenleri ve yetişkin PCFUs için, sıçan ECM içeren koloni deneyi gerçekleştirmek için gereken teknikler Mesc türetilmiş progenitörleri 17,18 ile aynıdır. Bu nedenle, testin bu yönleri burada tekrar edilmeyecektir; yerine aşağıdaki prosedürler ele alınacaktır: 1) yetişkin pankreas ayrışma ve yetişkin farelerin 7, 2) sıralanmış hücrelerin tek hücreli manipülasyon, 3) Tek koloni gelen PCFUs zenginleştirmek CD133 + SOX9 / EGFP + duktal hücreleri, sıralama mikroakışkan Mah-PCR ve tüm montaj immün ve Colonie 4) ayrışmasını kullanarak analizlertek hücre süspansiyonu ve içine s fare ECM veya laminin hidrojel koloni deneyleri içine yeniden kaplama.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Hydrogel</td>
			<td>Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td>
			<td></td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Flacon Conical vial</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mmx20mm Suspension culture dish</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase1</td>
			<td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td>
			<td>11088831001</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101310</td>
			<td>low endotoxin, azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>400522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133-Biotin</td>
			<td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>13-1331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Allophycocyanin</td>
			<td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>3571</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mucin 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td>
			<td>HM-1630-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>127-495-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td>
			<td>10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td>
			<td>101</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>205310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td>
			<td>0017-000-121</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>T-4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40um Filter Mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um filter mesh</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 96 Well Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924 (Previously 83.1835)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cc Syringe</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48.48 Dyanmic Array Chip</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>BMK-M-48.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td>85000800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish</td>
			<td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm petri dish with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Piece/ Rubber Tubing</td>
			<td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td>
			<td>MP-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin B</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>659-AB</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendin 4</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>E7144</td>
			<td>Stock kept at -20oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1</td>
			<td>R&#38;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td>Stock kept at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&#160;</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Black Well Plate</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flat, clear bottom with lid.&#160; Black polystyrene TC-treated microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD&#160;</td>
			<td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td>
			<td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas

Kök ve yetişkin pankreas progenitör hücreler tip 1 şeker hastalığı olan hastaları tedavi etmek için terapötik bir beta-benzeri hücrelerin potansiyel bir kaynak olabilir. kök ve progenitör hücrelerin yetişkin pankreas mevcut olup olmadığını Bununla birlikte, hala bilinmemektedir. Yetişkin farelerde soy-tracing CRE-lox kullanarak araştırma stratejileri desteği ya da iki beta hücreleri kanalları, yetişkin pankreas atalarıdır bulunabilir tahmin yerden oluşturulabilir fikrini çürütmek olduğunu sonuçlar vermiştir. Bunlar, in vivo CRE-lox soy-izleme yöntemleri, ancak, kendini yenileme ve bir kök hücre tanımlamak için gerekli olan multi-soy farklılaşma iki kriter sorulara cevap veremez. Bu teknik boşluğu ele başlamak için, biz pankreas atalarıdır için 3 boyutlu koloni deneyleri tasarladı. Yakında bizim ilk yayınlanmasından sonra, diğer laboratuarlar bağımsız organoid tahlil denilen benzer, fakat özdeş değildir, yöntemi geliştirdi. organoid tahlil ile karşılaştırıldığında, bizim yöntem kullanırdüşük konsantrasyonlarda hücre dışı matris proteinlerinin dahil edilmesine izin yapışkan solüsyonlar oluşturur metilselüloz,. birçok yetişkin organı kök hücreleri için olduğu gibi metilselüloz içeren deneyler, daha kolay tespit ve progenitorlar küçük bir alt-nüfusu meydana getirdiğinde kritik olan tek hücre düzeyinde projenitör hücrelerinin analizleri izin verir. Birlikte, birkaç laboratuar sonuçları farelerden pankreatik progenitör benzeri hücrelerin in vitro kendini yenileme ve çok nesilli farklılaşmasında göstermektedir. Geçerli protokoller fare pankreas atalarıdır karakterize etmek iki metilselüloz tabanlı koloni analizler açıklanmaktadır; biri laminin hidrojel olarak bilinen murin hücre dışı matris proteinlerinin bir ticari preparatıdır ve diğer yapay hücre dışı matris protein içerir. Burada gösterilen teknikler 1) pankreas ayrışma ve CD133 + SOX9 / EGFP sıralama erişkin farelerin + duktal hücreler, s 2) tek bir hücre manipülasyon vardırorted hücreler, 3) tek bir koloni kendini yenileme veya farklılaşmasını değerlendirmek için ikincil koloni deneyleri içine mikroakışkan QRT-PCR ve tüm montaj immün ve tek hücre süspansiyonları ve yeniden kaplama içine birincil kolonilerin 4) ayrışmayı kullanarak analiz eder.

Yetişkin pankreatik progenitör hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırma (Şekil 1) ile zenginleştirilmiş olabilir. ~ SOX9 20 75 kb yukan ve ~ 150 kb aşağı sekansları burada kullanılan SOX9 / EGFP transgenik fare hattı ilk GENSAT Beyin Atlas Proje 19 bir sonucu olarak oluşturulan ve EGFP raportör ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom kontrolü altındadır . Bu farelerde, EGFP verimli ve özellikle 22 pankreas kan...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas at JoVE.com

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...