Name: generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds at JoVE.com

Wir wünschen Dr. Rossant und Dr. Bilodeau für die Nkx2-1 mCherry ESC in den Experimenten in den Figuren 1-3 dargestellt verwendet danken. FACS wurde in der Sickkids-UHN Flow Cytometry Einrichtung durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes für Gesundheitsforschung und Infrastrukturbeihilfe (CSCCD) von der kanadischen Stiftung für Innovation arbeitet.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Animal Care Committee Richtlinien des Hospital for Sick Children Research Institute durchgeführt. 1. Scaffold Vorbereitung <ol><li> Dezellularisierung der Lunge <ol><li> Euthanize erwachsenen Wistar - Ratten mit CO 2 Kammer. Platzieren Tier in der Kammer und starten 100% CO 2 Exposition bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. <ol><li> Beobachten Tier für Bewusstlosigkeit; Dies wird nach ca. 2-3 min auftreten. Wenn...

<ol>
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Das hier beschriebene Protokoll erzeugt reifen ESC-derived Atemwegsepithelien nur natürliche Lungengerüste mit Differenzierung keine andere Ergänzung zu lenken. Diese Kultur Aufbau ist, serumfrei, kostengünstig und reproduzierbar definiert ist. Keine Wachstumsfaktor Ergänzung der Basis Differenzierung Medien erforderlich ist. Vorveröffentlichten Verfahren zur Erzeugung von Stammzellen abgeleiteten Lungenepithelzellen haben 2-dimensionale Strategien mit Wachstumsfaktor - Supplementierung verwendet 3,4,8,18,19<...

Regie Differenzierung von pluripotenten Zellen in die Lunge Linie ist abhängig von präzisen Signalereignisse in der Mikroumgebung 1,2. Aufgrund der dynamischen Natur dieses Prozesses schwierig es ist , die genauen Vorgänge von Lungen Organogenese in vitro nachzuahmen. Jüngste Berichte haben schrittweise lineage Beschränkungsstrategien mit löslichen Wachstumsfaktor Supplementierung von zweidimensionalen Kulturen verwendet , um Lungendifferenzierung 3-8 erzielen. In schrittweise Differenzierung Protokolle, pluripotente Zellen, ob embryonale Stammzellen (ESC) oder induzierte pluripotente Stammzellen wurden zuerst auf die endgültige Endoderm Keimschicht unterschieden. Endodermalen Zellen wurden anschließend in einer anterioren Endoderm Schicksal geschoben und danach Lungen Progenitorzellen, wie durch die Expression von homeodomain enthaltenden Transkriptionsfaktor NKX2-1 identifiziert. Diese Lungen Vorläufern wurden weiter nach proximal differenzierten (Atemweg) oder distalen (alveolären) Lungenepithelzellen with weiterhin Wachstumsfaktor Ergänzung. Solchen 2-dimensional Strategien gewissen Erfolg gehabt haben Lungenepithelzellen bei der Erzeugung sind jedoch mehrere Einschränkungen, einschließlich unklar Wirkungsgrade, eine mögliche Kontamination von anderen endodermalen Abstammungslinien, das Fehlen eines 3-dimensionalen (3D) Struktur, und in einigen Fällen verwenden undefinierter Kulturen mit Serumergänzung. Kultur pluripotenter oder differenzierten Zellen auf dezellularisierten Lungengerüste wird zunehmend als ein Assay verwendet , um das Regenerationspotential gesäten Zellen in Bilden Lungenepithelzellen Strukturen 3,5,6,8,9 zu beurteilen. Solche Berichte Kulturzellen auf Gerüsten mit anhaltendem Wachstumsfaktor oder Serum-Supplementierung ausgesät. Lungenentwicklung beinhaltet die Division, die Migration, die Genexpression und Differenzierung von einzelnen Zellen als Reaktion auf Umweltreize. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ein Gitterwerk von Glykoproteinen, die zusätzlich zur strukturellen Unterstützung, lenkt tissue Morphogenese durch die Integration und diese Prozesse 10,11 regulieren. Durch die Verwendung von Kultur die Lunge ECM Gerüst als natürliche Plattform für Endoderm um besser auf die in vivo - Lungenentwicklungs milieu nachahmen, haben wir Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege in einem definierten 3D-Kultur erzeugt mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit einstellen. Rattenlunge ECM Gerüste wurden von Dezellularisierung erzeugt sowie Maus ESC-derived Entodermzellen wurden erzeugt und anschließend ausgesät auf diese Gerüste. Dual-Expression von CXCR4 und c-KIT-Proteine ​​zeigt eine definitive endoderm Zellidentität und Zellen, die positiv für beide SOX2 &amp; NKX2-1 Ausdruck als Atemweg (proximal Lunge) Vorläuferzellen identifiziert. Definitive Entodermzellen wurden bei Luft Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) für bis zu drei Wochen funktionelle Epithelzellen der Atemwege in vitro zu erzeugen. Dieses Protokoll fördert Lungen lineage Differenzierung von definitive endoderm so früh wie 7 Tage mit der Entstehung von NKX2-1 beobachtet + / SOX2 + frühen proximalen Lungen Vorläufern. Am Tag 14 und 21 der Kultur reifen Atemwegsepithelzellen Zellpopulationen emerge einschließlich bewimpert (TUBB4A +), Club (SCGB1A1 +) und basalen (TRP63 +, KRT5 +) Zellen mit morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit nativem Maus Atemwege. Dieses Protokoll zeigt die Bedeutung der 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Erzielung robust Differenzierung Epithelzellen Atemwege.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">H0777</td>
			<td style="width:281px;">10U/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">14170112</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS-)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">CHA003</td>
			<td style="width:281px;">8mM CHAPS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">E9884</td>
			<td style="width:281px;">25mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">SOD002</td>
			<td style="width:281px;">1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Novagen</td>
			<td style="width:168px;">70664-3</td>
			<td style="width:281px;">90U/mL Benzonase nuclease&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15140</td>
			<td style="width:281px;">200U/mL penicillin streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15290</td>
			<td style="width:281px;">25&#956;g/mL amphotericin B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Trypsinization&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12605-028</td>
			<td style="width:281px;">TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">IMDM 2440-053, F12 11765-054</td>
			<td style="width:281px;">3:1 ratio of IMDM and Ham&#8217;s modified F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12587-010</td>
			<td style="width:281px;">B27 supplement (50x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">17502-048</td>
			<td style="width:281px;">N2 supplement (100x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">15260-037</td>
			<td style="width:281px;">0.05% (Fraction V) bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">35050-061</td>
			<td style="width:281px;">200mM Glutamax&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">M6145</td>
			<td style="width:281px;">4&#956;M monothioglycerol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">A4403&#160;</td>
			<td style="width:281px;">0.05mg/mL ascobic acid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Endoderm induction</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:168px;">338-AC/CF</td>
			<td style="width:281px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibodies</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CDH1</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">610181</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">C-KIT</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558163</td>
			<td style="width:281px;">Rat, PE-Cy7, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CXCR4</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558644</td>
			<td style="width:281px;">Rat, APC, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">KRT5</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab24647</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">NKX2-1</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab76013</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:163px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:168px;">NB300-144</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SCGB1A1</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-9772&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SOX2</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:168px;">AF2018&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TRP63</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-8431</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TUBB4A</td>
			<td style="width:163px;">BioGenex</td>
			<td style="width:168px;">MU178-UC</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-11055</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21202</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31571</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21206</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31573</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Other Materials</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low adherent plates</td>
			<td style="width:163px;">Nunc</td>
			<td style="width:168px;">Z721050&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Low cell binding plates,&#160; 6 wells&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Air-liquid interface membranes&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">110614</td>
			<td>Hydrophobic Nucleopore membrane, 8&#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S&#160;</td>
			<td>Leica Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tissue Adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td align="right">10033</td>
			<td>Pelco tissue adhesive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds

Lung lineage Differenzierung erfordert Integration komplexer Umweltreize, die Wachstumsfaktor-Signalgebung umfassen Zell-Zell-Wechselwirkungen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Aufgrund dieser Komplexität ist herausfordernd Rekapitulation der Lungenentwicklung in vitro Differenzierung von Stammzellen zu Lungenepithelzellen zu fördern. In diesem Protokoll werden dezellularisierte Lungengerüste verwendet, um die 3-dimensional Umgebung der Lunge zu imitieren und Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege zu erzeugen. embryonalen Stammzellen der Maus werden zunächst in die endoderm Linie differenziert, um eine Embryoidkörperbildung (EB) Kulturverfahren unter Verwendung von mit Activin A. Endoderm Zellen werden dann auf dezellularisiert Gerüste und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche für bis zu 21 Tage. Diese Technik fördert die Differenzierung von ausgesäten Zellen zu funktionellen Epithelzellen der Atemwege (Zilienzellen, Club-Zellen, und basalen Zellen) ohne zusätzliche Wachstumsfaktor Ergänzung. Diese Kultur Setup definiert ist, serum frei, kostengünstig und reproduzierbar ist. Obwohl es nur begrenzte Kontamination von nicht-Lungen-endoderm Abstammungslinien in Kultur ist, erzeugt dieses Protokoll nur epithelialen Populationen Atemwegs und führt nicht zu Alveolarepithelzellen geben. Airway Epithelien mit diesem Protokoll erzeugt wird, kann verwendet werden, Zell-Matrix-Interaktionen während Lunge Organogenese und für Krankheitsmodelle oder Drogen-Entdeckung Plattformen der Atemwegsbedingten Krankheiten wie Mukoviszidose zu studieren.

Wie in diesem Protokoll skizzierten robust Differenzierung definitive Endoderm zu reifen Atemwegsepithelzellen unter Verwendung von erweiterten Kultur beimpft Zellen auf dezellularisierten Gerüsts Lungenabschnitte erreicht werden kann. Es wird empfohlen, dezellularisierte Gerüste (1) Wirtszellen vollständig entfernt, um sicherzustellen, charakterisiert sind, und (2) extrazelluläre Matrix-Proteine ​​werden vor der Verwendung von Gerüsten für die Differenzierung erhalten. Dezellu...

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Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Forschung

Biotechnik

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...