Name: generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds at JoVE.com

우리는 그림 1-3에 묘사 된 실험에 사용 된 Nkx2-1의 mcherry의 ESC 박사 Rossant 박사 Bilodeau을 감사드립니다. FACS는 SickKids-UHN 유동 세포 계측법 시설에서 수행되었다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 및 혁신 캐나다 재단 인프라 보조금 (CSCCD)에서 보조금을 운영에 의해 지원되었다.

동물 실험은 아픈 어린이 연구소 대한 병원의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 비계 준비 <ol><li> 폐의 탈세 포화 <ol><li> CO 2 챔버를 사용하여 성체 위 스타 래트를 안락사. 챔버에서 동물을 놓고 분당 챔버 체적 10-30 %의 충전 속도 100 % CO 2 노출을 시작합니다. <ol><li> 무의식에 대한 동물을 관찰; 이 약 2 ~ 3 분 후에 발생합니다. 의식이 기간에 발생하지 않으면, ?...

<ol>
	<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factors,+Matrices,+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells.">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine.">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells.">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li><li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT.">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li></ol>

여기에 설명 된 프로토콜은 다른 보충제와 차별화를 직접 천연 폐 비계를 사용하여 성숙한 ESC 유래기도 상피 세포를 생성합니다. 이 문화의 설정은, 무 혈청, 저렴하고 재현성 정의된다. 기본 차별화 미디어의 어떠한 성장 인자 보충이 필요하지 않습니다. 줄기 세포 유래 폐 상피 세포를 생성 이전에 발행 된 방법은 혈통 제한 3,4,8,18,19을 촉진하는 성장 인자 보충과 2 차원의 전략을 사용하...

폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 1, 2에 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 3,5,6,8,9 구조를 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종. 폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 10, 11를 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다. 쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 &amp; C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다. 이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 + / SOX2 + 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A +), 클럽 (SCGB1A1의 +) 및 기저 (TRP63 +, KRT5 +) 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">H0777</td>
			<td style="width:281px;">10U/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">14170112</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS-)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">CHA003</td>
			<td style="width:281px;">8mM CHAPS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">E9884</td>
			<td style="width:281px;">25mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">SOD002</td>
			<td style="width:281px;">1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Novagen</td>
			<td style="width:168px;">70664-3</td>
			<td style="width:281px;">90U/mL Benzonase nuclease&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15140</td>
			<td style="width:281px;">200U/mL penicillin streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15290</td>
			<td style="width:281px;">25&#956;g/mL amphotericin B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Trypsinization&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12605-028</td>
			<td style="width:281px;">TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">IMDM 2440-053, F12 11765-054</td>
			<td style="width:281px;">3:1 ratio of IMDM and Ham&#8217;s modified F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12587-010</td>
			<td style="width:281px;">B27 supplement (50x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">17502-048</td>
			<td style="width:281px;">N2 supplement (100x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">15260-037</td>
			<td style="width:281px;">0.05% (Fraction V) bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">35050-061</td>
			<td style="width:281px;">200mM Glutamax&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">M6145</td>
			<td style="width:281px;">4&#956;M monothioglycerol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">A4403&#160;</td>
			<td style="width:281px;">0.05mg/mL ascobic acid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Endoderm induction</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:168px;">338-AC/CF</td>
			<td style="width:281px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibodies</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CDH1</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">610181</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">C-KIT</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558163</td>
			<td style="width:281px;">Rat, PE-Cy7, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CXCR4</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558644</td>
			<td style="width:281px;">Rat, APC, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">KRT5</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab24647</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">NKX2-1</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab76013</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:163px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:168px;">NB300-144</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SCGB1A1</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-9772&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SOX2</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:168px;">AF2018&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TRP63</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-8431</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TUBB4A</td>
			<td style="width:163px;">BioGenex</td>
			<td style="width:168px;">MU178-UC</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-11055</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21202</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31571</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21206</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31573</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Other Materials</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low adherent plates</td>
			<td style="width:163px;">Nunc</td>
			<td style="width:168px;">Z721050&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Low cell binding plates,&#160; 6 wells&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Air-liquid interface membranes&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">110614</td>
			<td>Hydrophobic Nucleopore membrane, 8&#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S&#160;</td>
			<td>Leica Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tissue Adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td align="right">10033</td>
			<td>Pelco tissue adhesive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds

폐 혈통 차별화는 성장 인자 신호 전달, 세포 - 세포 상호 작용 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함하는 복잡한 환경 단서의 통합이 필요합니다. 이 때문에 복잡성, 체외에서 폐 개발의 재현부는 도전 된 폐 상피 세포로 줄기 세포의 분화를 촉진합니다. 이 프로토콜에서, decellularized 폐 비계 줄기 세포 유래기도 상피 세포 폐의 3 차원 환경을 모방하고 생성하기 위해 사용된다. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 decellularized 지지체 상에 시딩 티빈 A를 내배엽 세포와 배아 체 (EB) 배양 방법을 이용하여 내배엽 계통으로 분화 최대 21 일 동안 공기 - 액체 계면에서 배양된다. 이 기술은 추가로 성장 인자를 보충하지 않고 작용기도 상피 세포에 접종 세포 (섬 모세포 클럽 세포 및 기저 세포)의 분화를 촉진한다. 이 문화의 설정이 정의되고, serum-무료, 저렴하고 재현성. 제한된 오염이 문화가 아닌 폐 내배엽 계통에서이 있지만,이 프로토콜은기도 상피 인구를 생성하고, 폐포 상피 세포에 상승을 제공하지 않습니다. 이 프로토콜 생성기도 상피는 폐 기관 형성 기간 동안 질병 모델링이나 낭포 성 섬유증과 같은기도 관련 병리의 약물 발견 플랫폼 세포 - 매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 최종 내배엽의 강력한 차별화 상피 세포가 decellularized 폐 비계 부분에 씨앗을 품고 세포의 확장 된 문화를 사용하여 달성 될 수기도 성숙한합니다. decellularized 지지체는 (1) 숙주 세포가 완전히 제거되도록하는 것을 특징으로한다, (2) 세포 외 매트릭스 단백질 분화 지지체를 사용하기 전에 보존하는 것이 권장된다. 도 1a에 도?...

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Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

연구

생체공학

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...