Name: microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00
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इस काम के हिस्से में एनआईएच R01 # DE021475 (सीटीएम), एक एनआईएच predoctoral प्रशिक्षण अनुदान 5T32GM007127 (पीएई), और एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (NAE) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम कैथरीन Lipari CRISPR सेंगर अनुक्रमण डेटा पैदा करने के लिए बीएसी recombineering और इंजेक्शन, निक Donde के प्रदर्शन के लिए केविन Schwalbach धन्यवाद, और इंजेक्शन प्रोटोकॉल पर उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए।

सभी मछली काम कैलिफोर्निया-बर्कले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या R330) द्वारा अनुमोदित किया गया था। 1. इंजेक्शन के लिए न्यूक्लिक एसिड तैयार <ol><li> Tol2 प्लाज्मिड tran...

transgenesis या जीनोम संपादन के लिए इंजेक्शन एक सेल की छोटी भ्रूण तीन मुख्य चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, zebrafish भ्रूण के सापेक्ष, की छोटी भ्रूण जरायु कठिन है और अक्सर सुइयों टूट जाएगा। इस समस्या को आंशि?...

समझ कैसे पैदा होती है जैव विविधता प्रकृति में विकसित प्ररूपी परिवर्तन के आनुवंशिक और विकास के ठिकानों का निर्धारण किया जाता है में से एक मौलिक घटक है। Threespine की छोटी मछली, Gasterosteus aculeatus, विकास के आनुवंशिक आधार के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में उभरा है। Sticklebacks कई अनुकूली विकासवादी बदलाव आया है के रूप में समुद्री मछली उत्तरी गोलार्द्ध भर में अनगिनत मीठे पानी वातावरण उपनिवेश है, नाटकीय रूपात्मक, शारीरिक, जिसके परिणामस्वरूप और व्यवहार में बदलाव 1। इक्कीस की छोटी आबादी से व्यक्तियों के जीनोम अनुक्रम किया गया है और इकट्ठे हुए, और एक उच्च घनत्व संबंध नक्शा आगे विधानसभा 2,3 सुधार करने के लिए उत्पन्न किया गया है। जेनेटिक मैपिंग के प्रयोगों जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान की है अंतर्निहित विकसित phenotypes 4 - 6, और कुछ मामलों में, विशिष्ट उम्मीदवार जीन की कार्यात्मक भूमिका 7.8 परीक्षण किया गया है। रूपात्मक परिवर्तन अंतर्निहित जीनोमिक क्षेत्रों के एक नंबर का वादा उम्मीदवार जीन के साथ पहचान की गई है, लेकिन इन उम्मीदवारों नहीं अभी तक कार्यात्मक 9 परीक्षण किया गया है - 12। इसके अलावा, sticklebacks जनसंख्या आनुवंशिकी / जीनोमिक्स 13,14, 15 स्पेशिएशन, व्यवहार 1, Endocrinology 16, ईकोटोकसीकोलौजी 17, इम्यूनोलॉजी 18 और परजीवी 19 के अध्ययन के लिए आम मॉडल हैं। इन क्षेत्रों में से प्रत्येक में भविष्य के अध्ययन sticklebacks में कार्यात्मक आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने की क्षमता से लाभ होगा। उनकी कोडिंग दृश्यों में हेर-फेर करने के अलावा, उम्मीदवार जीन की भूमिका उनकी सीआईएस -regulatory दृश्यों का अध्ययन करके और कार्यात्मक रूप में वृद्धि, कम, या उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति को नष्ट करने से मूल्यांकन किया जा सकता है। Sticklebacks में Microinjection और transgenesis तरीकों अच्छी तरह से 7,8,20 स्थापित कर रहे हैं और शुरू में विकसित किए गए प्रयोग एक meganuclease की मध्यस्थताविधि 21 पहले medaka 22 में वर्णित है। संशोधित microinjection यहाँ प्रस्तुत विधि दोनों Tol2 की मध्यस्थता transgenesis के लिए अनुकूलित किया गया है और हाल ही में TALENS और CRISPRs सहित जीनोम संपादन अभिकर्मकों विकसित की है। सीआईएस -regulatory तत्वों में परिवर्तन, रूपात्मक विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है के रूप में सीआईएस -regulatory परिवर्तन म्यूटेशन 23 कोडिंग के नकारात्मक pleiotropic परिणामों से बचने कर सकते हैं। इसलिए, परीक्षण और ख्यात सीआईएस -regulatory दृश्यों की तुलना विकासवादी अध्ययन के एक बढ़ती हुई संख्या के एक केंद्रीय लक्ष्य बन गया है। इसके अलावा, सबसे मानव रोग वेरिएंट नियामक वेरिएंट 24,25, और मॉडल कशेरुकी सिस्टम कष्टदायी सीआईएस -regulatory तत्व समारोह और तर्क का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं। मछली है कि उनके भ्रूण बड़ी संख्या में बाहर से खाद सीआईएस -regulation अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली कशेरुकी सिस्टम प्रदान करते हैं। Tol2 transposon प्रणाली, जिसमें foreiजीएन डीएनए जीनोम में एकीकृत किया जा Tol2 Transposase बाध्यकारी साइटों और से घिरे हुए है Tol2 Transposase mRNA के साथ सह इंजेक्शन, सफलतापूर्वक एकीकृत करने प्लाज्मिड मछली जीनोम 26 में निर्माणों के लिए उच्च दक्षता के साथ काम करता है - 28। आमतौर पर, एक संभावित बढ़ाने एक बेसल प्रमोटर (जैसे hsp70l 29) के रूप में और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन ऐसे EGFP के रूप में (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या mCherry एक Tol2 रीढ़ की हड्डी में नदी के ऊपर क्लोन और Transposase mRNA 26 के साथ इंजेक्शन है। अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की, या तो इंजेक्शन भ्रूण या स्थिरतापूर्वक एकीकृत transgenes साथ संतानों में से अवलोकन, जीन अभिव्यक्ति के spatiotemporal विनियमन ख्यात बढ़ाने के द्वारा संचालित के बारे में जानकारी प्रदान करता है। आगे के प्रयोगों में, मान्य enhancers ब्याज की जीन के ऊतक विशेष overexpression ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बड़ा सीआईएस -regulatory क्षेत्रों का विश्लेषण, उच्च गुणवत्ता वाले बड़े डालने के लिए Genomजीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बेक्स) का उपयोग आईसी पुस्तकालयों दोनों समुद्री और मीठे पानी sticklebacks 30 के लिए निर्माण किया गया है। ये बेक्स एक बड़े (150-200 केबी) के संदर्भ में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन जीनोमिक क्षेत्र 31 के साथ एक जीन को बदलने के लिए recombineered जा सकता है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में तो बीएसी के भीतर विनियामक दृश्यों द्वारा निर्धारित एक spatiotemporal पैटर्न में व्यक्त किया जाता है। मछली में पढ़ाई के लिए, Tol2 साइटों जीनोमिक एकीकरण की सुविधा के लिए 32,33 बीएसी करने के लिए जोड़ा जा सकता है। विकास के बाद के चरणों जब सीटू संकरण में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, बीएसी के फ्लोरोसेंट readout, जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न का अध्ययन करने के रूप में की छोटी हड्डी morphogenetic प्रोटीन 6 (Bmp6) 20 के लिए दिखाया गया है इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक व्यक्ति में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति पैटर्न समय है, जो सीटू संकरण में से पूरा नहीं किया जा सकता है पर नज़र रखी जा सकती है। बेक्स भी एक additiona जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएक जीनोमिक क्षेत्र के एल कॉपी ब्याज की एक जीन की खुराक बढ़ाने के लिए। जीन समारोह के अध्ययन के लिए, जीनोम संपादन एक विस्फोट के विस्तार क्षेत्र है कि जीवों 34 की एक विस्तृत विविधता में जीनोमिक दृश्यों के लिए लक्षित परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) मॉड्यूलर, अनुक्रम विशिष्ट न्युक्लिअसिज़ मूल संयंत्र रोगज़नक़ों कि ठीक पसंद का एक जीनोमिक अनुक्रम को सीधे बाँध और एक डबल कतरा तोड़ 35,36 उत्पन्न करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता से अलग कर रहे हैं। संकुल नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / कैस सिस्टम मूल रूप से बैक्टीरिया में पाया जाता है और एक गाइड शाही सेना और Cas9 प्रोटीन का प्रयोग कर एक लक्ष्य डीएनए अनुक्रम गाइड 37 के पूरक में एक को तोड़ने उत्पन्न करने के लिए किया गया। अक्सर दोनों TALENS और CRISPRs द्वारा बनाई गई डबल कतरा तोड़ के बाद मरम्मत एक छोटे से सम्मिलन या विलोपन, जो लक्ष्य अनुक्रम का कार्य बाधित कर सकते हैं पीछे छोड़ देता है35-37। Sticklebacks में, TALENS एक बढ़ाने को लक्षित 20 से जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और दोनों TALENS और CRISPRs सफलतापूर्वक दृश्यों (अप्रकाशित डेटा) कोडिंग में म्यूटेशन का उत्पादन किया है। Zebrafish में उपयोग के लिए CRISPRs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता sticklebacks 38 के लिए CRISPRs विकसित करने के लिए। ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन प्रयोगों एक नव निषेचित एक सेल भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की शुरूआत की आवश्यकता होती है। ट्रांस्जीन या जीनोम संपादन उपकरण विकास में जल्दी शुरू करके, भ्रूण में आनुवंशिक छेड़छाड़ बेटी कोशिकाओं की संख्या अधिकतम है। इंजेक्शन भ्रूण तो नेत्रहीन प्रतिदीप्ति के लिए जांच कर रहे हैं या molecularly जीनोम संशोधनों के लिए जांच की। germline के लिए योगदान दे कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लक्षित कर रहे हैं, तो ट्रांस्जीन या उत्परिवर्तन वंश के एक सबसेट को पारित किया जा सकता है, यहां तक ​​कि जब बाद इंजेक्शन मारक अधिक है। पच्चीकारी मछली outcrossed जा सकता है याintercrossed और उनके वंश उत्परिवर्ती alleles या ब्याज की एक स्थिरतापूर्वक एकीकृत transgene ठीक करने के लिए जांच की। इस प्रोटोकॉल एक सेल की छोटी भ्रूण में ट्रांसजीन और जीनोम संपादन अभिकर्मकों शुरू करने और सफल जीनोमिक संशोधन के लिए निगरानी के लिए विधियों का वर्णन।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

threespine की छोटी मछली रूपात्मक, शारीरिक की एक विस्तृत विविधता के आनुवंशिक आधार अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली, और व्यवहार phenotypes के रूप में उभरा है। उल्लेखनीय विविध phenotypes कि के रूप में समुद्री आबादी अनगिनत मीठे पानी के वातावरण के लिए अनुकूल विकसित किया है, समुद्री और मीठे पानी रूपों को पार करने की क्षमता के साथ संयुक्त, एक दुर्लभ कशेरुकी प्रणाली है जिसमें आनुवांशिकी जीनोमिक क्षेत्रों नक्शा करने के लिए विकसित लक्षण नियंत्रित किया जा सकता है प्रदान करते हैं। उत्कृष्ट जीनोमिक संसाधनों अब उपलब्ध हैं, विकसित परिवर्तन की आणविक आनुवंशिक विच्छेदन की सुविधा। जबकि मानचित्रण प्रयोगों दिलचस्प उम्मीदवार जीन की सूची उत्पन्न, कार्यात्मक आनुवंशिक जोड़तोड़ इन जीनों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं। जीन विनियमन ट्रांसजेनिक संवाददाता प्लास्मिड और बेक्स जीनोम Tol2 Transposase प्रणाली का उपयोग करने में एकीकृत के साथ अध्ययन किया जा सकता है। विशिष्ट उम्मीदवार जीन और सीआईएस -regulatory तत्वों के कार्य को निशाना बनाया उत्प्रेरण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकताTALEN और CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन अभिकर्मकों के साथ म्यूटेशन। सभी तरीकों निषेचित एक सेल की छोटी भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड शुरू करने की आवश्यकता होती है, एक काम की छोटी भ्रूण की मोटी जरायु और अपेक्षाकृत छोटे और पतले blastomere से चुनौतीपूर्ण बना दिया। इधर, एक प्रकार की छोटी भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति और समारोह का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन अनुप्रयोगों, साथ ही transgenesis की सफलता का आकलन करने और स्थिर लाइनों को ठीक करने के लिए तकनीक के लिए वर्णित है।

पत्रकार जीन ट्रांसजीन बढ़ाने गतिविधि है कि के लिए, सफल इंजेक्शन ट्रांस्जीन (चित्रा -4 ए, 4C) के विशिष्ट, सेलुलर अभिव्यक्ति में परिणाम होगा। इंजेक्शन मछली तो स्थिर लाइनों (बीएसी स?...

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Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine sticklebacks में transgenesis और जीनोम एडिटिंग के लिए Microinjection

ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ और जीनोम संपादन कार्यात्मक जीन और सीआईएस -regulatory तत्वों की भूमिका के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहाँ जीनोमिक संशोधनों (Tol2 की मध्यस्थता फ्लोरोसेंट संवाददाता transgene निर्माणों, TALENS, और CRISPRs सहित) की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत microinjection प्रोटोकॉल आकस्मिक मॉडल मछली, threespine की छोटी के लिए प्रस्तुत किया है।

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Research

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Developmental Biology

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

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Chromatin नियामकों और अमेरिका में जीनोम चौड़ा स्नैपशॉट<em&gt; Xenopus</emचिप Seq द्वारा&gt; भ्रूण

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

ट्यूमर रोगजनन में उम्मीदवार सहकारी जीन की कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए मोज़ेक Zebrafish transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em&gt; Xenopus</em&gt; किडनी

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

मटर Aphid भ्रूण में immunostaining के लिए गंभीर स्थिति की पहचान: ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि धुंधला घटाना

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

भ्रूण Microinjection और electroporation कोरडेट में<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा के अनुकूलित Microinjection और इमेजिंग के लिए Microstructured उपकरण

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

जीनोम संपादन द्वारा Drosophila में ऊतक विशिष्ट द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली पैदा करने के लिए एक कुशल रणनीति

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-आधारित प्रणाली के लिए Vivo में भ्रूण Cardiomyocytes के प्रत्यारोपण में एवियन भ्रूण

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

फायरब्रेट थर्मोबिया डोमेस्टिका में जीनोम संपादन के लिए अंडा माइक्रोइंजेक्शन और कुशल संभोग

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...