Name: design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications
Uploaded: 2016-06-23T13:00:00
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This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.

1. Synthèse via Citrate Réduction des nanoparticules d&#39;or (AUNP) et caractérisation <ol><li> Nettoyer un Erlenmeyer (500 ml) et une grande barre d&#39;agitation avec 5 ml d&#39;acide nitrique concentré et 15 ml d&#39;acide chlorhydrique concentré dans le capot de la sécurité chimique. <ol><li> Mouiller toute la surface du flacon avec le lavage à l&#39;acide, rincer le ballon avec de l&#39;eau sans nucléase, et laisser le ballon à sécher. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ml de 1 mM d&#39;or (III), le chlo...

<ol>
	<li>Housecroft, C., Constable, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).</li><li>Bunka, D., Stockley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age-at+last.">Aptamers come of age-at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanoparticle-Based+Colorimetric+Assay+for+the+Direct+Detection+of+Cancerous+Cells.">Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells.</a> Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).</li><li>Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+for+biology+and+medicine.">Gold nanoparticles for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).</li><li>Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+in+bioanalytical+applications.">Aptamer in bioanalytical applications.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).</li><li>Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Ch&#225;vez, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li><li>Alivasatos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+nanocrustal+molecules+using+DNA.">Organization of nanocrustal molecules using DNA.</a> Nature. 382, 609-611 (1996).</li><li>Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmodified+gold+nanoparticles+as+a+colorimetric+probe+for+potassium+DNA+aptamers.">Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers.</a> Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+colorimetric+sensing+of+adenosine+and+cocaine+based+on+a+general+sensor+design+involving+aptamers+and+nanoparticles.">Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles.</a> Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).</li><li>Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-functionalized+Au+nanoparticles+for+the+amplified+optical+detection+of+thrombin.">Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Hermann, T., Patel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+recognition+by+nucleic+acid+aptamers.">Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.</a> Science. 287 (5454), 820-825 (2000).</li><li>Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+therapeutics+advance.">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).</li><li>Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+biosensors.">Aptamer-based biosensors.</a> TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).</li><li>Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+aptamer-based+colorimetric+sensing+of+protein+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles.</a> Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).</li><li>Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+colorimetric+biosensing+of+dopamine+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles.</a> Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).</li><li>Ch&#225;vez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates:+effect+of+aptamer+length+on+response.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).</li><li>Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction.">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles.">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li><li>Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Conjugated+Nanoparticle+for+the+Collection+and+Detection+of+Multiple+Cancer+Cells.">Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells.</a> Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).</li><li>Martin, J., Ch&#225;vez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol.">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li><li>Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+colorimetric+detection+with+a+smartphone.">Point-of-care colorimetric detection with a smartphone.</a> Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).</li><li>Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+colourimetric+tests+for+trinitrotoluene+(TNT)+in+soil.">Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil.</a> Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).</li></ol>

Au cours de la dernière décennie, les nanoparticules à base de dosages colorimétriques ont été développés pour la détection de cibles comprennent de petites molécules, l&#39; ADN, les protéines et les cellules 2-4. Les analyses qui utilisent l&#39;ADN-aptamères avec des nanoparticules ont gagné l&#39;intérêt. En général, ces essais colorimétriques sont réalisées en mélangeant l&#39;ADN aptamère avec des molécules d&#39;analytes , puis on ajoute à 9-10 AuNPs. Cependant, ces e...

La colorimétrie est l&#39;une des techniques les plus anciennes utilisées dans la chimie analytique. Pour cette technique, une détermination qualitative ou quantitative de l&#39;analyte est effectuée en fonction de la production d&#39;un composé coloré 1. En règle générale, des dosages de couleurs utilisent des réactifs qui subissent un changement de couleur en présence de l&#39;espèce d&#39;analyte, ce qui se traduit par un changement de couleur observable ou détectable dans le spectre de la lumière visible. Colorimétrie a été utilisé dans la détection de cibles allant des atomes, des ions et des petites molécules à des molécules biologiques complexes , tels que les acides désoxyribonucléiques (ADN), des peptides et des protéines 2-4. Pour les deux dernières décennies, les nanomatériaux ont révolutionné le domaine des tests de détection, en particulier avec des essais à base de couleurs 5-6. En combinant les propriétés chimiques et physiques uniques des nanomatériaux avec un élément de reconnaissance sélective de la cible, tels que des anticorps, des aptamères d&#39;oligonucléotides ou des aptamères peptidiques, a conduit à la résurgence in la conception et le développement de tests de détection colorimétriques 7. les nanoparticules métalliques ont une propriété de changement de couleur dépendant de la taille démontrée, qui a été exploité dans la conception de nombreux essais colorimétriques. Les nanoparticules d&#39;or (AuNPs) sont d&#39; un intérêt particulier en raison d&#39;un changement de couleur rouge-à-bleu distinctif, lorsque la solution dispersée de particules est amené à agréger 8, généralement par l&#39;addition précise de sel. La capacité de contrôler le passage de la dispersion (rouge) (bleu) des états agrégés a conduit à la création de capteurs colorimétriques pour ionique faible moléculaire, un peptide, une protéine, et des cibles cellulaires 2-4,9. Un grand nombre de ces capteurs utilisent des aptamères que le motif de reconnaissance de la cible. Les aptamères sont l&#39; ADN ou de l&#39; acide ribonucléique (ARN) des molécules sélectionnées parmi un groupe aléatoire de 10 12 -10 15 séquences différentes 10-11. Le processus de sélection identifie re cibleéléments cognitifs avec des affinités de liaison du régime de nanomoles, et l&#39;évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) est le procédé le plus communément appelé 12-13. Les avantages d&#39;aptamères à base d&#39;oligonucléotides pour des applications de détection comprennent la facilité de synthèse, la modification chimique contrôlable, et la stabilité chimique 14-15. Une approche pour la création d&#39;un dosage colorimétrique combine les nanomatériaux avec des éléments de reconnaissance, consiste à combiner ces deux espèces par l&#39;adsorption physique de molécules d&#39;ADN-aptamère aux surfaces AUNP. Par liaison cible aptamères, les aptamères subit un changement structurel 16-18 qui modifie l&#39;interaction de l&#39;aptamère avec la surface AUNP, ce qui conduit à une réponse de couleur rouge au bleu 19 inductible par l&#39;addition de sel. Cette caractéristique étonnante de AuNPs fournit un mécanisme de réponse colorimétrique observable pour les appareils à base aptamères qui peuvent être utilisés pour désigner essais colorimétriques pour différents analytes. des essais de couleurs conçus à l&#39;aide non-covalentes, aptamères ADN physiquement adsorbées sur les surfaces AUNP ont le stigmate d&#39;être une faible plate-forme de capteur en raison de problèmes avec la robustesse, une propension à l&#39;échec en dehors des paramètres de laboratoire contrôlées, et le manque d&#39;informations disponibles pour une utilisation dans la pratique paramètres. Cependant, le dosage colorimétrique à base aptamère AUNP présente un intérêt en raison de la simplicité de fonctionnement et de la réponse de couleur observable. Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la conception, le développement, l&#39;exploitation, la réduction de la surface liée réponse faux positif, et le stockage à long terme de l&#39;ADN-AUNP essais colorimétriques à base en utilisant la cocaïne comme l&#39;analyte représentatif. En outre, nous avons proposé cette adsorbé aptamère approche d&#39;essai (Figure 1) comme étant avantageuse en raison de la simplicité et la facilité d&#39;utilisation qui a entraîné moins d&#39; étapes que l&#39;approche conventionnelle pour ces ass aptamère-AUNPays. Pour ce dosage, l&#39;aptamère a été ajouté aux AuNPs, qui ont été autorisés à adsorber à la surface pendant une période de temps prolongée. Un avantage supplémentaire de cette approche a été la réduction de la réponse aux molécules d&#39;analyte non-cibles liées aux interactions de surface AUNP. Toutefois, la réduction de la réponse faussement positifs a été au détriment de la sensibilité du test. Par conséquent, un équilibre entre la protection de surface et de l&#39;analyte accessibilité est nécessaire pour maintenir le bon fonctionnement du test. En outre, un défaut majeur de l&#39;analyse des essais de couleurs par des moyens autres que l&#39;instrumentation est que les résultats sont souvent subjectifs et ouverts à l&#39;interprétation de l&#39;analyste à l&#39;analyste, en particulier lors de la tentative de différencier les différences subtiles de couleur. A l&#39; inverse, il y a un certain nombre de problèmes avec rendant l&#39; instrumentation de laboratoire à base utilisable en dehors du laboratoire, tels que la disponibilité de la puissance, l&#39;aspect pratique avec la portabilité, etc. Dans ce travail, un protocole d&#39;analyse de la couleur a été développé pour more portabilité et d&#39;éliminer une partie de la conjecture souvent associée à essai à base de l&#39; interprétation des couleurs 20-21. Par rapport aux approches précédentes, cet effort efforcé de pousser ces essais à leurs limites pour des applications au-delà des paramètres de laboratoire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254169</td>
			<td>99.999% purity is important and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy</td>
			<td>Bio-TEK</td>
			<td>HT</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J848</td>
			<td>Any sterilized brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, 250 mL Filter System, 0.22 &#181;m cellulose acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430767</td>
			<td>Other membranes have been found to remove the AuNPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrophophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 300&#160;</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63068</td>
			<td>&#8805;98% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procaine Hydrochloride</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>AC20731-1000</td>
			<td>99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td>36.5-38.0% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-156-HC-1LM</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A509-SK212</td>
			<td>65% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td>Sterile solutions made from solid will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758-25 mL</td>
			<td>&#8805;97% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecgoninemethylester Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-205-HC-1LM</td>
			<td>We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-722</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications

La conception et le développement d&#39;une nanoparticule aptamère-or (AUNP) dosage colorimétrique pour la détection de petites molécules pour des applications dans le terrain a été examiné. des essais de couleurs à base cible de AUNP sélective ont été développés dans des milieux contrôlés preuve de concept en laboratoire. Cependant, ces régimes n&#39;ont pas été exercée à un point de défaillance pour déterminer leur utilisation pratique au-delà des paramètres de laboratoire. Ce travail décrit une approche générique pour concevoir, développer et dépanner un dosage colorimétrique aptamère-AUNP pour les petits analytes de molécules et en utilisant le test pour les paramètres dans le terrain. L&#39;essai est avantageuse car aptamères adsorbées passiver les surfaces de nanoparticules et de fournir un moyen de réduire et d&#39;éliminer les fausses réponses positives aux analytes non cibles. Transitioning ce système pour des utilisations pratiques nécessaires définissant non seulement la durée de vie de l&#39;essai aptamère-AUNP, mais établir des méthodes et des procédures d&#39;extension à long terme capabil de stockageITIES. En outre, l&#39;une des préoccupations reconnues avec lecture colorimétrique est le fardeau imposé aux analystes d&#39;identifier avec précision les changements souvent subtiles dans la couleur. Pour diminuer la responsabilité sur les analystes dans le domaine, un protocole d&#39;analyse de la couleur a été conçue pour remplir les fonctions d&#39;identification de couleur sans la nécessité d&#39;effectuer cette tâche sur les équipements de qualité laboratoire. Le procédé pour créer et tester le protocole d&#39;analyse des données est décrit. Cependant, pour comprendre et influencer la conception des essais aptamères adsorbées, les interactions associées à l&#39;aptamère, cible et AuNPs nécessitent une étude plus approfondie. Les connaissances acquises pourrait conduire à adapter les aptamères pour une meilleure fonctionnalité.

<html> L&#39;objectif principal de ce travail était de développer et étudier la stabilité et la robustesse de l&#39;aptamère base AUNP essais colorimétriques pour une utilisation sur le terrain. Comme l&#39;a souligné dans une publication précédente, deux stratégies distinctes pour la création de l&#39;essai ont été étudiés 7. Les essais ont été appelés le aptamères Assay gratuit et adsorbées aptamères Assay. Le test a été adsorbées aptamère plus attray...

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Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

La conception et le développement d&#39;un test nanoparticule colorimétriques aptamère-or pour la détection de petites molécules pour des applications dans le terrain a été examiné. En outre, une application smart-colorimétriques dispositif (app) a été validée et le stockage à long terme de l&#39;essai a été mis en place pour une utilisation dans le domaine.

Conception et développement d&#39;aptamères-or à base de nanoparticules colorimétriques Assays pour In-the-champ Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The overall goal is to provide a general approach for the development of an aptamer-gold nanoparticle based colorimetric assay for the detection of target molecules, and to provide approaches to improve long-term storage and reduce false positive response rates. This methods answers key questions in the field of gold nanoparticle aptamer colorimetric assays such as the reproducibility of the assays in the field for long-term storage and reducing false positive response rate. These assays can be prone to issues with shelf-life and false positive responses.In this work, we improve over both of these issues. Clean a 500-milliliter Erlenmeyer flask and large stir bar with five milliliters of concentrated nitric acid and 15 milliliters of concentrated hydrochloric acid in a chemical safety hood. Wet the entire surface of the flask with the acid wash.Then rinse the flask with nuclease-free water and allow the flask to dry. Add 100 milliliters of one millimolar gold three chloride. Use a sheet of aluminum foil to cover the top of the acid-cleaned Erlenmeyer flask and heat with continuous stirring on a hot plate until boiling.Next, add 10 milliliters of 38.8 millimolar sodium citrate. The color will change from clear or gray to dark blue or black, and finally to dark to red over several minutes. Continue stirring with the heat off for 10 minutes.Allow the gold nanoparticle suspension to cool to room temperature and add 110 microliters of DEPC with continuous stirring. Cover the entire flask with aluminum foil and allow the DEPC treatment to incubate overnight. The next day, autoclave the gold nanoparticle suspension.Then cool to room temperature and filter through a 0.22 micron pore cellulose acetate membrane. Store the filtered, autoclaved gold nanoparticle stock solution in the dark at four degrees Celsius. Calculate the gold nanoparticle concentration as described in the text protocol.Here, the concentration was calculated to be 10 nanomolar with a size of 15 nanometers as determined by dynamic light scattering. Purchase or synthesize the cocaine-binding aptamer sequences using standard phosphoramidite chemistry. After purifying the aptamers using standard desalting, reconstitute oligonucleotides in nuclease-free water at either 100 micromolar or one millimolar stock solutions.Aliquoted purified aptamers can be stored at 20 degrees Celsius for several months. Combine the DNA with the 10 nanomolar stock gold nanoparticle solution, varying the volume of gold nanoparticles as desired, to provide enough sample for the test to be performed. Incubate the mixture for three to four hours at room temperature and protect from the light.Add an equal volume of 20 millimolar HEPES, two millimolar magnesium chloride and pH 7.4 buffer, and place the sample at four degrees Celsius in the dark overnight. The initial salt concentration needed to induce the assay color response by salt titration is determined with the assay blank. Add 20 microliters of methanol to 180-microliter aliquots of the aptamer-gold chloride assay in a 96-well plate.A critical step in the performance of these assays is to determine the sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles once the target has been added. Titrate the samples with increasing volumes of stock sodium chloride solution and determine the equivalence point. Here, determine the sodium chloride volume needed to cause the slightest color change by visual observation.Optimizing the assay response, add 20 microliters of analyte molecules diluted in methanol to 180-microliter aliquots of aptamer-gold nanoparticle assay in a 96-well plate at room temperature. Immediately, add the sodium chloride concentration determined in the previous step to initiate the assay color response. Obtain the largest color change possible by increasing or decreasing the sodium chloride concentration and comparing the target response to the blank response.Use the sodium chloride concentration that provides the largest response difference. Observe or measure the assay response 150 seconds following sodium chloride addition. Analyze the absorbance at 650 nanometers and 530 nanometers, using a spectrophotometer.Plot the results as the ratio of absorbance obtained at 650 nanometers and 530 nanometers as a function of analyte concentration. Normalize the assay response to the blank signal. Prepare the aptamer-gold nanoparticle assay components as described earlier in the video.Make separate solutions containing one gram per milliliter of trehalose and one gram per milliliter of sucrose in nuclease-free water to make the cryogen solution. So a critical step in freezing these assays is determining how much trehalose and sucrose solutions to add to the samples to ensure total and even freezing. Make a solution that contains 19.2 milligrams per milliliter of trehalose and 4.8 milligrams per milliliter of sucrose with the 60 MN4 DNA per gold nanoparticle assay at a final volume of 200 microliters in 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Final cryogen solution concentrations will vary with DNA coverage. Flash freeze the samples using a 146 degrees Celsius freezer or in liquid nitrogen. Store the samples frozen until use.For this work, leave the samples in the 146 degrees Celsius freezer overnight and then transfer to a 20 degrees Celsius freezer for long-term storage. Shown here are representative results of sodium chloride titration curves for untreated and DNA aptamer-treated gold nanoparticles. The initial sodium chloride concentration used in the assay was determined by titration.Representative results of the aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay for cocaine and control molecules are shown here. The graphs reveal the effect that increasing the DNA coverage density has on the false positive response rate of the cocaine assay. Shown here are the calibration curve plots obtained from photoimage analysis of the cocaine colorimetric assay.Photos obtained using smartphones. Representative results of the assay response of aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay to cocaine and control molecules are presented here. The data compares samples freshly prepared to samples stored frozen up to four weeks.While attempting this procedure, it is very important to determine the proper sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles and promote the typical color change upon addition of the target. So after watching this video, you should have a good understanding of how to develop gold nanoparticle aptamer colorimetric assays for the detection of targets of interest. You can use the approaches outlined here to reduce false positive response rates and keep your assays viable for more than a month.

Research

JoVE Journal

Biology

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Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Développement de nouvelles applications thérapeutiques utilisant la microfluidique

Recherche

Biologie

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