Name: design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications
Uploaded: 2016-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of AptamerÃ¢â‚¬â€œGold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications at JoVE.com

This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.

1. סינתזה באמצעות הפחתת ציטראט של ננו-חלקיקי זהב (AuNP) ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניקוי בקבוק Erlenmeyer (500 מיליליטר) ו בר ומערבבים גדולים עם 5 מיליליטר מרוכז חומצה חנקתית 15 מיליליטר מרוכז חומצה הידרוכלורית במנדף בטיחות הכימי. <ol style=";text-align:right;di...

<ol>
	<li>Housecroft, C., Constable, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).</li><li>Bunka, D., Stockley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age-at+last.">Aptamers come of age-at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanoparticle-Based+Colorimetric+Assay+for+the+Direct+Detection+of+Cancerous+Cells.">Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells.</a> Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).</li><li>Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+for+biology+and+medicine.">Gold nanoparticles for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).</li><li>Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+in+bioanalytical+applications.">Aptamer in bioanalytical applications.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).</li><li>Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Ch&#225;vez, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li><li>Alivasatos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+nanocrustal+molecules+using+DNA.">Organization of nanocrustal molecules using DNA.</a> Nature. 382, 609-611 (1996).</li><li>Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmodified+gold+nanoparticles+as+a+colorimetric+probe+for+potassium+DNA+aptamers.">Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers.</a> Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+colorimetric+sensing+of+adenosine+and+cocaine+based+on+a+general+sensor+design+involving+aptamers+and+nanoparticles.">Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles.</a> Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).</li><li>Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-functionalized+Au+nanoparticles+for+the+amplified+optical+detection+of+thrombin.">Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Hermann, T., Patel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+recognition+by+nucleic+acid+aptamers.">Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.</a> Science. 287 (5454), 820-825 (2000).</li><li>Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+therapeutics+advance.">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).</li><li>Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+biosensors.">Aptamer-based biosensors.</a> TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).</li><li>Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+aptamer-based+colorimetric+sensing+of+protein+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles.</a> Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).</li><li>Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+colorimetric+biosensing+of+dopamine+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles.</a> Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).</li><li>Ch&#225;vez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates:+effect+of+aptamer+length+on+response.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).</li><li>Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction.">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles.">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li><li>Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Conjugated+Nanoparticle+for+the+Collection+and+Detection+of+Multiple+Cancer+Cells.">Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells.</a> Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).</li><li>Martin, J., Ch&#225;vez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol.">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li><li>Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+colorimetric+detection+with+a+smartphone.">Point-of-care colorimetric detection with a smartphone.</a> Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).</li><li>Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+colourimetric+tests+for+trinitrotoluene+(TNT)+in+soil.">Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil.</a> Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).</li></ol>

במהלך העשור האחרון, מבחני colorimetric מבוסס ננו-חלקיקים פותחו לצורך זיהוי של מטרות כוללים מולקולות קטנות, DNA, חלבונים, תאים 2-4. מבחני המשתמשות DNA-aptamers עם חלקיקים כבר צובר ריבית. בדרך כלל, מבחני colorimetric אלה מבוצעים על ידי ערבוב-aptamer דנ&quot;א עם מולקולות אנליטי ואחריו בנוסף ...

Colorimetry הוא אחת הטכניקות העתיקות ביותר בשימוש בכימיה אנליטית. עבור טכניקה זו, קביעה איכותית או כמותית של אנליטי שתעלה בהתבסס על ייצור של תרכובת בצבע 1. בדרך כלל, מבחני צבע להשתמש ריאגנטים כי לחוות שינוי צבע בנוכחות של מיני אנליטי, שתוצאתה שינוי צבע נצפה או לגילוי בספקטרום האור הנראה. Colorimetry נעשה שימוש זיהוי של מטרות, החל אטומים, יונים, ומולקולות קטנות למולקולות ביולוגיות מורכבות כגון חומצות deoxyribonucleic (DNA), פפטידים, חלבונים 2-4. במשך שני העשורים האחרונים, ננו חולל מהפכה בתחום מבחני איתור, במיוחד עם מבחנים מבוססים צבע 5-6. שילוב התכונות הכימיות ופיסיקליות הייחודיות של ננו עם אלמנט הכרת סלקטיבית היעד, כגון נוגדנים, aptamers oligonucleotide או aptamers פפטיד, הוביל אל תחייתה in בתכנון ופיתוח של מבחני זיהוי colorimetric 7. חלקיקי מתכת יש נכס שינוי צבע גודל תלוי הפגין, אשר נוצל בעיצוב של מבחני colorimetric רבים. חלקיקי זהב (AuNPs) הם בעלי עניין מיוחד בשל שינוי צבע אדום-אל-כחול ייחודי, כאשר הפתרון של חלקיקים מפוזרים מושרה כדי לצבור 8, בדרך כלל באמצעות תוספת מדויקת של מלח. היכולת לשלוט על המעבר מן התפזר (אדום) אל המדינות המצטברות (הכחולה) הובילה ליצירת חיישני colorimetric עבור יוניים, קטן מולקולרי, פפטיד, חלבון, ומטרות הסלולר 2-4,9. רבים של חיישנים אלה להעסיק aptamers כמוטיב זיהוי מטרות. Aptamers הוא DNA או חומצה ריבונוקלאית (RNA) מולקולות שנבחר מתוך מאגר אקראי של 10 12 -10 15 רצפים שונים 10-11. תהליך הבחירה מזהה מחדש יעדאלמנטים קוגניציה עם זיקות מחייבות במשטר nanomolar הנמוך, ואת האבולוציה השיטתית של ligands על ידי עשרת מעריכים (Selex) הוא התהליך ביותר הידוע בכינויו 12-13. יתרונותיו של aptamers המבוסס oligonucleotide עבור יישומי חישה כוללים וקלות הסינתזה, שינוי כימי לשליטה, ואת יציבות כימית 14-15. גישה אחת יצירת assay colorimetric משלבת ננו עם אלמנטי הכרה, מורכב משלב שני המינים הללו באמצעות הספיחה הפיסית של מולקולות aptamer-DNA למשטחי AuNP. דרך-aptamer היעד מחייב, aptamer חווה שינוי מבני 16-18, שמשנה את האינטראקציה של aptamer עם המשטח AuNP, מה שמוביל בתגובה צבע אדום-אל-כחול מושרה 19 בתוספת מלח. תכונה מדהימה זו של AuNPs מספקת מנגנון תגובה colorimetric הנצפה למכשירים מבוססי aptamer שניתן להשתמש לדהלחתום מבחני colorimetric עבור analytes שונים. מבחני צבע המעוצבים באמצעות הלא קוולנטיים, aptamers DNA adsorbed פיזית על משטחי AuNP יש את הסטיגמה של להיות פלטפורמת חיישן חלשה עקב בעיות עם איתנות, נטייה לכישלון מחוץ הגדרות מעבדה מבוקרות, וחוסר המידע הזמין לשימוש מעשי הגדרות. עם זאת, assay colorimetric מבוסס aptamer-AuNP היה עניין בגלל הפשטות של פעולה ותגובה צבע הנצפה. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול בתכנון, פיתוח, תפעול, צמצום השטח הקשורים תשובה חיובית כוזבת, אחסון לטווח ארוך של מבחני colorimetric מבוסס DNA-AuNP באמצעות קוקאין כמו אנליטי נציג. יתר על כן, הצענו גישה assay aptamer adsorbed זו (איור 1) כמו להיות יתרון בשל הפשטות וקלות השימוש שכתוצאה ממנה בפחות שלבים מאשר הגישה המקובלת עבור התחת אלה aptamer-AuNPays. עבור assay זה, aptamer נוספה לראשונה AuNPs, אשר הורשו לספוג אל פני השטח במשך תקופה ארוכה של זמן. יתרון נוסף לגישה זו היה צמצום בתגובה מולקולות אנליטי יעד שאינו קשור אינטראקציות פני AuNP. עם זאת, הירידה בתגובה חיובית כוזבת הייתה על חשבון רגישות assay. לכן איזון בין הגנת משטח ונגישות אנליטי יש צורך לשמור על תפקוד נאה assay. יתר על כן, פגם עמוק ועיקרי של ניתוח מבחני צבע באמצעים אחר מלבד עם המכשור הוא כי התוצאות הן בדרך כלל סובייקטיבי פתוחים לפרשנות אנליסט אל אנליסט, במיוחד כאשר מנסים לבדל הבדלים דקים בצבע. לעומת זאת, ישנם מספר נושאים עם קבלת במכשור מעבדה מבוסס שמיש מחוץ למעבדה, כגון זמינות של כוח, פרקטיות עם ניידות, וכו &#39;בעבודה זו, פרוטוקול ניתוח צבע פותחה עבור מורדואר ניידות לבטל חלק את הניחושים נפוצים הקשורים פרשנות assay מבוסס צבע 20-21. בהשוואה לגישות קודמות, המאמץ הזה שאף לדחוף מבחנים אלה עד קצה גבול היכולת שלהם עבור יישומים מעבר הגדרות במעבדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254169</td>
			<td>99.999% purity is important and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy</td>
			<td>Bio-TEK</td>
			<td>HT</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J848</td>
			<td>Any sterilized brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, 250 mL Filter System, 0.22 &#181;m cellulose acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430767</td>
			<td>Other membranes have been found to remove the AuNPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrophophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 300&#160;</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63068</td>
			<td>&#8805;98% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procaine Hydrochloride</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>AC20731-1000</td>
			<td>99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td>36.5-38.0% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-156-HC-1LM</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A509-SK212</td>
			<td>65% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td>Sterile solutions made from solid will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758-25 mL</td>
			<td>&#8805;97% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecgoninemethylester Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-205-HC-1LM</td>
			<td>We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-722</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications

העיצוב והפיתוח של ננו-חלקיקים aptamer-זהב (AuNP) assay colorimetric לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. יעד מבחני צבע סלקטיבי מבוסס AuNP פותחו הגדרות במעבדה הוכחה של קונספט מבוקר. עם זאת, תוכניות אלה לא הופעלו עד לנקודה של אי לקבוע השימוש המעשי שלהם מעבר להגדרות מעבדה. עבודה זו מתארת ​​גישה גנריות כדי לתכנן, לפתח, ולפתור ב assay colorimetric aptamer-AuNP עבור analytes מולקולה קטנה באמצעות assay עבור in-the-שדה הגדרות. Assay הוא יתרון משום aptamers adsorbed passivate משטחים ננו-חלקיקים ולספק אמצעי לצמצם ולמנוע תגובות חיוביות כוזבות analytes היעד הלא. מעבר למערכת זו שימושים מעשיים הנדרשת בהגדרה לא רק את חיי המדף של assay aptamer-AuNP, אלא מאשש שיטות ונהלים להארכת capabil האחסון לטווח הארוךities. כמו כן, אחת הדאגות מוכרת עם ההודעה colorimetric הוא את הנטל שהועמס על אנליסטים לזהות במדויק לעתים קרובות שינויים קלים בצבע. כדי להפחית את האחריות על אנליסטים בתחום, פרוטוקול ניתוח צבע נועד למלא את תפקידי זיהוי צבע ללא צורך בביצוע משימה זו על ציוד מעבדה כיתה. השיטה ליצירה ובדיקת פרוטוקול ניתוח נתונים מתוארת. עם זאת להבין ולהשפיע על העיצוב של מבחני aptamer adsorbed, האינטראקציות קשורות aptamer, היעד, ואת AuNPs דורשת מחקר נוסף. הידע שנצבר יכול להוביל תפירת aptamers עבור פונקציונליות משופרת.

<html> המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הייתה לפתח ולחקור את יציבותה וחוסנה של aptamer מבוסס מבחני colorimetric AuNP לשימוש בתחום. מודגש כמו בפרסום קודם, שתי אסטרטגיות ברורות ליצירת assay נחקרו 7. המבחנים וכונו את assay Aptamer חינם ואת Assay Aptamer adsorbed. את assay Aptamer adsorbed היה י?...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of AptamerÃ¢â‚¬â€œGold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications at JoVE.com

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

העיצוב והפיתוח של assay colorimetric nanoparticle aptamer-זהב לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. בנוסף, יישום colorimetric חכם-התקן (אפליקציה) קיבלה תוקף ו אחסון לטווח ארוך של assay הוקמה לשימוש בתחום.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The overall goal is to provide a general approach for the development of an aptamer-gold nanoparticle based colorimetric assay for the detection of target molecules, and to provide approaches to improve long-term storage and reduce false positive response rates. This methods answers key questions in the field of gold nanoparticle aptamer colorimetric assays such as the reproducibility of the assays in the field for long-term storage and reducing false positive response rate. These assays can be prone to issues with shelf-life and false positive responses.In this work, we improve over both of these issues. Clean a 500-milliliter Erlenmeyer flask and large stir bar with five milliliters of concentrated nitric acid and 15 milliliters of concentrated hydrochloric acid in a chemical safety hood. Wet the entire surface of the flask with the acid wash.Then rinse the flask with nuclease-free water and allow the flask to dry. Add 100 milliliters of one millimolar gold three chloride. Use a sheet of aluminum foil to cover the top of the acid-cleaned Erlenmeyer flask and heat with continuous stirring on a hot plate until boiling.Next, add 10 milliliters of 38.8 millimolar sodium citrate. The color will change from clear or gray to dark blue or black, and finally to dark to red over several minutes. Continue stirring with the heat off for 10 minutes.Allow the gold nanoparticle suspension to cool to room temperature and add 110 microliters of DEPC with continuous stirring. Cover the entire flask with aluminum foil and allow the DEPC treatment to incubate overnight. The next day, autoclave the gold nanoparticle suspension.Then cool to room temperature and filter through a 0.22 micron pore cellulose acetate membrane. Store the filtered, autoclaved gold nanoparticle stock solution in the dark at four degrees Celsius. Calculate the gold nanoparticle concentration as described in the text protocol.Here, the concentration was calculated to be 10 nanomolar with a size of 15 nanometers as determined by dynamic light scattering. Purchase or synthesize the cocaine-binding aptamer sequences using standard phosphoramidite chemistry. After purifying the aptamers using standard desalting, reconstitute oligonucleotides in nuclease-free water at either 100 micromolar or one millimolar stock solutions.Aliquoted purified aptamers can be stored at 20 degrees Celsius for several months. Combine the DNA with the 10 nanomolar stock gold nanoparticle solution, varying the volume of gold nanoparticles as desired, to provide enough sample for the test to be performed. Incubate the mixture for three to four hours at room temperature and protect from the light.Add an equal volume of 20 millimolar HEPES, two millimolar magnesium chloride and pH 7.4 buffer, and place the sample at four degrees Celsius in the dark overnight. The initial salt concentration needed to induce the assay color response by salt titration is determined with the assay blank. Add 20 microliters of methanol to 180-microliter aliquots of the aptamer-gold chloride assay in a 96-well plate.A critical step in the performance of these assays is to determine the sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles once the target has been added. Titrate the samples with increasing volumes of stock sodium chloride solution and determine the equivalence point. Here, determine the sodium chloride volume needed to cause the slightest color change by visual observation.Optimizing the assay response, add 20 microliters of analyte molecules diluted in methanol to 180-microliter aliquots of aptamer-gold nanoparticle assay in a 96-well plate at room temperature. Immediately, add the sodium chloride concentration determined in the previous step to initiate the assay color response. Obtain the largest color change possible by increasing or decreasing the sodium chloride concentration and comparing the target response to the blank response.Use the sodium chloride concentration that provides the largest response difference. Observe or measure the assay response 150 seconds following sodium chloride addition. Analyze the absorbance at 650 nanometers and 530 nanometers, using a spectrophotometer.Plot the results as the ratio of absorbance obtained at 650 nanometers and 530 nanometers as a function of analyte concentration. Normalize the assay response to the blank signal. Prepare the aptamer-gold nanoparticle assay components as described earlier in the video.Make separate solutions containing one gram per milliliter of trehalose and one gram per milliliter of sucrose in nuclease-free water to make the cryogen solution. So a critical step in freezing these assays is determining how much trehalose and sucrose solutions to add to the samples to ensure total and even freezing. Make a solution that contains 19.2 milligrams per milliliter of trehalose and 4.8 milligrams per milliliter of sucrose with the 60 MN4 DNA per gold nanoparticle assay at a final volume of 200 microliters in 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Final cryogen solution concentrations will vary with DNA coverage. Flash freeze the samples using a 146 degrees Celsius freezer or in liquid nitrogen. Store the samples frozen until use.For this work, leave the samples in the 146 degrees Celsius freezer overnight and then transfer to a 20 degrees Celsius freezer for long-term storage. Shown here are representative results of sodium chloride titration curves for untreated and DNA aptamer-treated gold nanoparticles. The initial sodium chloride concentration used in the assay was determined by titration.Representative results of the aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay for cocaine and control molecules are shown here. The graphs reveal the effect that increasing the DNA coverage density has on the false positive response rate of the cocaine assay. Shown here are the calibration curve plots obtained from photoimage analysis of the cocaine colorimetric assay.Photos obtained using smartphones. Representative results of the assay response of aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay to cocaine and control molecules are presented here. The data compares samples freshly prepared to samples stored frozen up to four weeks.While attempting this procedure, it is very important to determine the proper sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles and promote the typical color change upon addition of the target. So after watching this video, you should have a good understanding of how to develop gold nanoparticle aptamer colorimetric assays for the detection of targets of interest. You can use the approaches outlined here to reduce false positive response rates and keep your assays viable for more than a month.

Research

JoVE Journal

Biology

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

הפיתוח של יישומים טיפולית חדשה באמצעות מיקרופלואידיקה

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

מדידה אבסולוטית קוונטית תשואה של דוגמאות אבקת

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

כיווני שאיפת תרסיס Nanoparticle כל הגוף

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...