Name: design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications
Uploaded: 2016-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of AptamerÃ¢â‚¬â€œGold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications at JoVE.com

This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.

1. Синтез с помощью цитрата Сокращение наночастиц золота (AuNP) и характеристика <ol><li> Очистите коническую колбу (500 мл) и большой мешалку с 5 мл концентрированной азотной кислоты и 15 мл концентрированной соляной кислоты в химическом защитном кожухе. <ol><li> Влажный всю поверхность колбы с ки...

<ol>
	<li>Housecroft, C., Constable, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).</li><li>Bunka, D., Stockley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+come+of+age-at+last.">Aptamers come of age-at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanoparticle-Based+Colorimetric+Assay+for+the+Direct+Detection+of+Cancerous+Cells.">Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells.</a> Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).</li><li>Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+for+biology+and+medicine.">Gold nanoparticles for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).</li><li>Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+in+bioanalytical+applications.">Aptamer in bioanalytical applications.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).</li><li>Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Ch&#225;vez, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li><li>Alivasatos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+nanocrustal+molecules+using+DNA.">Organization of nanocrustal molecules using DNA.</a> Nature. 382, 609-611 (1996).</li><li>Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmodified+gold+nanoparticles+as+a+colorimetric+probe+for+potassium+DNA+aptamers.">Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers.</a> Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+colorimetric+sensing+of+adenosine+and+cocaine+based+on+a+general+sensor+design+involving+aptamers+and+nanoparticles.">Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles.</a> Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).</li><li>Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-functionalized+Au+nanoparticles+for+the+amplified+optical+detection+of+thrombin.">Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li><li>Hermann, T., Patel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+recognition+by+nucleic+acid+aptamers.">Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.</a> Science. 287 (5454), 820-825 (2000).</li><li>Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+therapeutics+advance.">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).</li><li>Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+biosensors.">Aptamer-based biosensors.</a> TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).</li><li>Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+aptamer-based+colorimetric+sensing+of+protein+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles.</a> Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).</li><li>Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+colorimetric+biosensing+of+dopamine+using+unmodified+gold+nanoparticles.">Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles.</a> Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).</li><li>Ch&#225;vez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates:+effect+of+aptamer+length+on+response.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).</li><li>Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction.">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles.">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li><li>Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Conjugated+Nanoparticle+for+the+Collection+and+Detection+of+Multiple+Cancer+Cells.">Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells.</a> Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).</li><li>Martin, J., Ch&#225;vez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol.">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li><li>Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+colorimetric+detection+with+a+smartphone.">Point-of-care colorimetric detection with a smartphone.</a> Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).</li><li>Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+colourimetric+tests+for+trinitrotoluene+(TNT)+in+soil.">Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil.</a> Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).</li></ol>

За последнее десятилетие, на основе наночастиц колориметрические анализы были разработаны для обнаружения целей , включают небольшие молекулы, ДНК, белки и клетки 2-4. Анализы, которые используют ДНК-аптамеров с наночастицами были все больший интерес. Как правило, эти колориметри?...

Колориметрия является одним из старейших методов, используемых в аналитической химии. Для реализации этой технологии, качественное или количественное определение аналита производится на основании производства окрашенного соединения 1. Как правило, цветные анализы используют реагенты, которые испытывают сдвиг цвета в присутствии вида аналита, что приводит к наблюдаемому или обнаруживаемое изменение цвета в спектре видимого света. Колориметрические был использован в обнаружении целей , начиная от атомов, ионов и малых молекул до сложных биологических молекул , таких как дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), пептидов и белков 2-4. За последние два десятилетия, наноматериалы революцию в области анализов обнаружения, особенно в анализах на основе цвета 5-6. Сочетание уникальных химических и физических свойств наноматериалов с элементом целевой селективного распознавания, такие как антитела, олигонуклеотидных аптамеров или пептидные аптамеры, привело к всплеску яп проектирование и разработка колориметрических анализов обнаружения 7. Наночастицы металлов имеют подтвержденную зависящее от размера, свойство изменения цвета, которое было использовано при разработке многочисленных колориметрических анализов. Наночастицы золота (AuNPs) представляют особый интерес из - за отличительного красного к синему сдвига цвета, когда дисперсный раствор частиц индуцируется агрегировать 8, как правило , за счет точного добавления соли. Способность контролировать переход от дисперсного (красный) с совокупными (синий) государств привело к созданию колориметрических датчиков для ионной, небольшой молекулярной, пептидов, белков и клеточных мишеней 2-4,9. Многие из этих датчиков используют аптамеров в качестве мотива цель распознавания. Аптамеры представляют собой ДНК или рибонуклеиновой кислоты (РНК) , молекулы , выбранные из случайного пула 10 12 -10 15 различных последовательностей 10-11. Процесс отбора определяет целевые повторнокогнитивные элементы с аффинностью связывания в режиме низкой наномолярной, и Систематическое выделение лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) является наиболее широко известным процессом 12-13. Преимущества аптамеры на основе олигонуклеотидных для приложений зондирования включают в себя простоту синтеза, управляемую химическую модификацию и химическую стабильность 14-15. Один из подходов к созданию колориметрического анализа сочетает в себе наноматериалы с элементами распознавания, состоит из сочетания этих двух видов через физической адсорбции ДНК-аптамеров молекул до AuNP поверхностей. С помощью связывания мишень-аптамеров, аптамер испытывает структурные изменения , которые изменяют 16-18 взаимодействие аптамеров с поверхностью AuNP, что приводит к индуцируемым красного к синему цвета реакции 19 с добавлением соли. Эта удивительная особенность AuNPs обеспечивает наблюдаемый колориметрического механизм реагирования для устройств аптамеров основе, которые могут быть использованы для снятиязнак колориметрических анализов для различных аналитов. Цветные анализы, разработанные с использованием нековалентных, физически адсорбированных аптамеры ДНК на AuNP поверхностях имеют клеймо быть слабым датчик платформы из-за проблем с надежностью, склонность к недостаточности вне контролируемых лабораторных условиях, а также отсутствие информации, доступной для использования в практической настройки. Тем не менее, на основе аптамеров-AuNP колориметрический анализ представляет интерес из-за простоты эксплуатации и наблюдаемой реакции цвета. Целью данной работы является создание протокола для проектирования, разработки, эксплуатации, уменьшение поверхности, связанных с ложной положительной реакции, а также длительного хранения ДНК-AuNP на основе колориметрического анализа с использованием кокаина в качестве репрезентативного аналита. Кроме того, мы предложили эту адсорбированный аптамеров анализа подход (Рисунок 1) как выгодно благодаря простоте и легкости в использовании , что привело к уменьшению числа стадий , чем при традиционном подходе для этих аптамеров-AuNP попкуAYS. Для этого теста, аптамер впервые был добавлен к AuNPs, которые позволяют адсорбироваться на поверхности в течение длительного периода времени. Дополнительным преимуществом такого подхода является сокращение реакции на нецелевых молекул аналита, связанных с поверхностными взаимодействий AuNP. Тем не менее, снижение ложных срабатываний ответ был за счет чувствительности анализа. Поэтому баланс между защитой поверхности и аналита доступности необходимо для поддержания нормальной функции анализа. Кроме того, основным недостатком анализа цветовых анализов с помощью иных средств, чем при помощи приборов является то, что результаты часто субъективны и открыты для интерпретации от аналитика к аналитику, в частности, при попытке дифференцировать тонкие различия в цвете. С другой стороны , существует целый ряд проблем , с возможностью создания на основе Instrumentation Laboratory полезной вне лаборатории, такие как наличие силы, практичности с портативностью и т.д. В этой работе, протокол анализа цвета был разработан для море портативность и устранить некоторые из догадок , обычно связанных с интерпретацией цвета на основе анализа 20-21. По сравнению с предыдущими подходами, это усилие стремится подтолкнуть этих анализов в свои пределы для применений, помимо лабораторных условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254169</td>
			<td>99.999% purity is important and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy</td>
			<td>Bio-TEK</td>
			<td>HT</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J848</td>
			<td>Any sterilized brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, 250 mL Filter System, 0.22 &#181;m cellulose acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430767</td>
			<td>Other membranes have been found to remove the AuNPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrophophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 300&#160;</td>
			<td>Any absorbance spectrometer will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63068</td>
			<td>&#8805;98% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procaine Hydrochloride</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>AC20731-1000</td>
			<td>99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td>36.5-38.0% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-156-HC-1LM</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A509-SK212</td>
			<td>65% w/w other brands will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150-1L</td>
			<td>Sterile solutions made from solid will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758-25 mL</td>
			<td>&#8805;97% any brand will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecgoninemethylester Hydrochloride</td>
			<td>Lipomed</td>
			<td>COC-205-HC-1LM</td>
			<td>We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-722</td>
			<td>We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of aptamer&#8211;gold nanoparticle based colorimetric assays for in-the-field applications

Дизайн и разработка аптамеров-наночастиц золота (AuNP) колориметрического анализа для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Целевая селективный AuNP цвета Анализы, основанные были разработаны в контролируемых доказательство правильности концепции лабораторных условиях. Тем не менее, эти схемы не оказывали до точки отказа, чтобы определить их практическое использование вне лабораторных условиях. Эта работа описывает общий подход для проектирования, разработки и устранения неисправностей в колориметрического анализа аптамеров-AuNP для малых аналитов молекулы и с использованием анализа для установки в полевых условиях. Анализ является предпочтительным, так как адсорбированные аптамеры пассивации поверхности наночастиц и обеспечивают средства для уменьшения и устранения ложных положительных ответов на нецелевых аналитов. Переходить эта система для практического использования требуется определения не только срок годности анализа аптамеров-AuNP, но создание методов и процедур для расширения долгосрочного хранения capabilностями. Кроме того, один из признанных проблем с колориметрического считывания является нагрузку на аналитиков, чтобы точно определить, часто тонкие изменения в цвете. Чтобы уменьшить ответственность на аналитиков в области, протокол цветовой анализ был разработан для выполнения цветовой идентификации обязанностей без необходимости выполнения этой задачи по лабораторным оборудованием класса. Способ создания и тестирования протокола анализа данных описан. Однако, чтобы понять и влиять на разработку адсорбированных аптамеров анализов, взаимодействия, связанные с аптамеров, цели и AuNPs требуют дальнейшего изучения. Полученные знания могут привести к покрой аптамеры для улучшенной функциональности.

<html> Основная цель данной работы заключалась в разработке и исследовать стабильность и надежность аптамеров на основе AuNP колориметрического анализа для использования в полевых условиях. Как было отмечено в предыдущей публикации, две различные стратегии для создания ...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of AptamerÃ¢â‚¬â€œGold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications at JoVE.com

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Дизайн и разработка анализа наночастиц колориметрического аптамеры золота для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Кроме того, смарт-устройство колориметрический приложение (приложение) было подтверждено и была создана для использования в полевых условиях длительного хранения анализа.

Проектирование и разработка аптамеров-Gold наночастицу Based колориметрического анализа для В полевых условиях приложений

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The overall goal is to provide a general approach for the development of an aptamer-gold nanoparticle based colorimetric assay for the detection of target molecules, and to provide approaches to improve long-term storage and reduce false positive response rates. This methods answers key questions in the field of gold nanoparticle aptamer colorimetric assays such as the reproducibility of the assays in the field for long-term storage and reducing false positive response rate. These assays can be prone to issues with shelf-life and false positive responses.In this work, we improve over both of these issues. Clean a 500-milliliter Erlenmeyer flask and large stir bar with five milliliters of concentrated nitric acid and 15 milliliters of concentrated hydrochloric acid in a chemical safety hood. Wet the entire surface of the flask with the acid wash.Then rinse the flask with nuclease-free water and allow the flask to dry. Add 100 milliliters of one millimolar gold three chloride. Use a sheet of aluminum foil to cover the top of the acid-cleaned Erlenmeyer flask and heat with continuous stirring on a hot plate until boiling.Next, add 10 milliliters of 38.8 millimolar sodium citrate. The color will change from clear or gray to dark blue or black, and finally to dark to red over several minutes. Continue stirring with the heat off for 10 minutes.Allow the gold nanoparticle suspension to cool to room temperature and add 110 microliters of DEPC with continuous stirring. Cover the entire flask with aluminum foil and allow the DEPC treatment to incubate overnight. The next day, autoclave the gold nanoparticle suspension.Then cool to room temperature and filter through a 0.22 micron pore cellulose acetate membrane. Store the filtered, autoclaved gold nanoparticle stock solution in the dark at four degrees Celsius. Calculate the gold nanoparticle concentration as described in the text protocol.Here, the concentration was calculated to be 10 nanomolar with a size of 15 nanometers as determined by dynamic light scattering. Purchase or synthesize the cocaine-binding aptamer sequences using standard phosphoramidite chemistry. After purifying the aptamers using standard desalting, reconstitute oligonucleotides in nuclease-free water at either 100 micromolar or one millimolar stock solutions.Aliquoted purified aptamers can be stored at 20 degrees Celsius for several months. Combine the DNA with the 10 nanomolar stock gold nanoparticle solution, varying the volume of gold nanoparticles as desired, to provide enough sample for the test to be performed. Incubate the mixture for three to four hours at room temperature and protect from the light.Add an equal volume of 20 millimolar HEPES, two millimolar magnesium chloride and pH 7.4 buffer, and place the sample at four degrees Celsius in the dark overnight. The initial salt concentration needed to induce the assay color response by salt titration is determined with the assay blank. Add 20 microliters of methanol to 180-microliter aliquots of the aptamer-gold chloride assay in a 96-well plate.A critical step in the performance of these assays is to determine the sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles once the target has been added. Titrate the samples with increasing volumes of stock sodium chloride solution and determine the equivalence point. Here, determine the sodium chloride volume needed to cause the slightest color change by visual observation.Optimizing the assay response, add 20 microliters of analyte molecules diluted in methanol to 180-microliter aliquots of aptamer-gold nanoparticle assay in a 96-well plate at room temperature. Immediately, add the sodium chloride concentration determined in the previous step to initiate the assay color response. Obtain the largest color change possible by increasing or decreasing the sodium chloride concentration and comparing the target response to the blank response.Use the sodium chloride concentration that provides the largest response difference. Observe or measure the assay response 150 seconds following sodium chloride addition. Analyze the absorbance at 650 nanometers and 530 nanometers, using a spectrophotometer.Plot the results as the ratio of absorbance obtained at 650 nanometers and 530 nanometers as a function of analyte concentration. Normalize the assay response to the blank signal. Prepare the aptamer-gold nanoparticle assay components as described earlier in the video.Make separate solutions containing one gram per milliliter of trehalose and one gram per milliliter of sucrose in nuclease-free water to make the cryogen solution. So a critical step in freezing these assays is determining how much trehalose and sucrose solutions to add to the samples to ensure total and even freezing. Make a solution that contains 19.2 milligrams per milliliter of trehalose and 4.8 milligrams per milliliter of sucrose with the 60 MN4 DNA per gold nanoparticle assay at a final volume of 200 microliters in 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Final cryogen solution concentrations will vary with DNA coverage. Flash freeze the samples using a 146 degrees Celsius freezer or in liquid nitrogen. Store the samples frozen until use.For this work, leave the samples in the 146 degrees Celsius freezer overnight and then transfer to a 20 degrees Celsius freezer for long-term storage. Shown here are representative results of sodium chloride titration curves for untreated and DNA aptamer-treated gold nanoparticles. The initial sodium chloride concentration used in the assay was determined by titration.Representative results of the aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay for cocaine and control molecules are shown here. The graphs reveal the effect that increasing the DNA coverage density has on the false positive response rate of the cocaine assay. Shown here are the calibration curve plots obtained from photoimage analysis of the cocaine colorimetric assay.Photos obtained using smartphones. Representative results of the assay response of aptamer-gold nanoparticle colorimetric assay to cocaine and control molecules are presented here. The data compares samples freshly prepared to samples stored frozen up to four weeks.While attempting this procedure, it is very important to determine the proper sodium chloride concentration to destabilize the gold nanoparticles and promote the typical color change upon addition of the target. So after watching this video, you should have a good understanding of how to develop gold nanoparticle aptamer colorimetric assays for the detection of targets of interest. You can use the approaches outlined here to reduce false positive response rates and keep your assays viable for more than a month.

Research

JoVE Journal

Biology

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Разработке новых терапевтических приложений с помощью Microfluidics

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Закрытая система культуре клеток протокола Использование HyperStack Суда с газопроницаемых Технология Материал

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Абсолютный квантовый выход Измерение порошковых проб

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Всего тела наночастиц Воздействие аэрозолей при вдыхании

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Токсикологические анализы для тестирования воздействию эпигенетические препарата на развития, плодовитость и выживаемость малярийных комаров

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Разработка ингибиторов белок-белковых взаимодействий через REPLACE: Приложение к проектированию и развитию Номера ATP Конкурсная CDK ингибиторов

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Способ выбора Структура переключения Аптамеры Применительно к колориметрическим наночастиц золота Пробирной

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Разработка коллоидного золота на основе Иммунохроматографические тест-полоски для обнаружения китообразных миоглобина

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...