Name: simultaneous dna-rna extraction from coastal sediments and quantification of 16s rrna genes and transcripts by real-time pcr
Uploaded: 2016-06-11T14:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR at JoVE.com

وقد انبثقت هذه النشرة من الأبحاث التي أجريت بدعم مالي من مجلس بحوث البيئة الطبيعية (NERC) تحت رقم منحة NERC NE / JO11959 / 1 و العلوم أيرلندا مؤسسة وللعمل COFUND ماري كوري تحت رقم جرانت 11 / SIRG / B2159awarded إلى CJS والأكاديمية اتحاد البحوث الشرقية (شرق ARC).

<ol>
	<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenomenon+of+microbial+uncultivability.">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li><li>Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+recovery+from+soils+of+diverse+composition.">DNA recovery from soils of diverse composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).</li><li>Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+optimization+of+DNA+extraction+and+purification+procedures+from+soil+and+sediments+samples.">Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).</li><li>Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+optimizing+quality+and+quantity+of+DNA+extracted+from+soil.">A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil.</a> J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).</li><li>Hurt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).</li><li>Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+coextraction+of+DNA+and+RNA+from+natural+environments+for+analysis+of+ribosomal+DNA-+and+rRNA-based+microbial+community+composition.">Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).</li><li>Martins, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lacustrine+sediment+bacteria+involved+in+nutrient+and+iron+cycles.">Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).</li><li>Kuffner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+season+and+experimental+warming+on+the+bacterial+community+in+a+temperate+mountain+forest+soil+assessed+by+16S+rRNA+gene+pyrosequencing.">Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).</li><li>Tatti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+over+winter+conditions+on+denitrification+and+nitrous+oxide-producing+microorganism+abundance+and+structure+in+an+agricultural+soil+amended+with+different+nitrogen+sources.">Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources.</a> Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).</li><li>Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+in+the+Sargasso+Sea+bacterioplankton.">Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton.</a> Nature. 345, 60-62 (1990).</li><li>Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+sequences+reveal+numerous+uncultured+microorganisms+a+natural+community.">16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community.</a> Nature. 345, 63-65 (1990).</li><li>Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+caused+by+template+annealing+in+the+amplification+of+mixture+of+16S+rRNA+genes+by+PCR.">Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).</li><li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification.">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22, 130-138 (1997).</li><li>Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Specific+Polymerase+Chain+Reaction+Product+by+Utilizing+the+5'+3'+Exonuclease+Activity+of+Thermus+aquaticus+DNA+Polymerase.">Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase.</a> PNAS. 88, 7276-7280 (1991).</li><li>Smith, C. J., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+quantitative+PCR+(Q-PCR)-based+approaches+in+microbial+ecology.">Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).</li><li>Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+archaeal+16S+rRNA+and+amoA+genes+to+estimate+the+abundance+and+diversity+of+ammonia-oxidizing+archaea+in+marine+sediments.">Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments.</a> Extremphiles. 12 (4), (2008).</li><li>Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+depth-related+population+variation+in+microbial+communities+of+a+coastal+marine+sediment+using+16S+rDNA-based+approaches+and+quinone+profiling.">Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling.</a> Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).</li><li>Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonia+process+rates+and+corresponding+key+functional+genes+along+an+estuarine+nitrate+gradient.">Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient.</a> Front. Microbiol. 6, 542 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a laboratory manual. , 205 (2001).</li><li>Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Quantitative+Polymerase+Chain+Reaction+(Q-PCR)+based+approaches+for+determining+gene+copy+and+gene+transcript+numbers+in+environmental+samples.">Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples.</a> Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).</li><li>Suzuki, M. T., Taylor, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeLong+E.F.,+Quantitative+analysis+of+small-subunit+rRNA+genes+in+mixed+microbial+population+via+5'-nuclease+assays.">DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).</li><li>Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+procedure:+a+critical+issue+for+bacterial+diversity+assessment+in+marine+sediments.">DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).</li><li>Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., &#352;antl-Temkiv, T., J&#248;rgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+method+for+the+extraction+of+DNA+and+RNA,+and+the+separation+of+DNA+pools+from+diverse+environmental+sample+types.">A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types.</a> Front. Microbiol. 6, 476 (2015).</li><li>Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+methods+for+RNA+and+DNA+in+marine+sediments:+maximizing+yield+while+overcoming+inhibition.">Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition.</a> FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).</li><li>Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+Operon+copy+number+reflects+ecological+strategies+of+bacteria.">rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria.</a> App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).</li><li>Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+metatrascriptomic+and+metagenomics+analyses+of+stratified+microbial+assemblages+in+the+open+ocean.">Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean.</a> ISME J. 5, 999-1013 (2011).</li><li>Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tringe+S.G.,+Tiedje+J.M.,+&amp;+Brown+C.T.+Tackling+soil+diversity+with+the+assembly+of+large,+complex+metagenomes.">Tringe S.G., Tiedje J.M., &amp; Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes.</a> PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).</li><li>Klaedtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terroir+is+a+key+driver+of+seed-associated+microbial+assemblages.">Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages.</a> Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+of+rRNA+and+DNA+reveals+a+dynamic+methylotroph+community+and+trophic+interactions+with+fungi+and+protozoa+in+oxic+rice+field+soil).">Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil).</a> Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>B&#252;rgmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Silicibacter+pomeroyi+DSS-3+to+dimethylsulfoniopropionate+(DMSP).">Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP).</a> Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).</li><li>He, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochip:+a+comprehensive+microarray+for+investigating+biogeochemical+ecological+and+environmental+processes.">Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes.</a> ISME J. 1, 67-77 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

مزيج من الحمض النووي استخراج / RNA مع QPCR يوفر، طريقة فعالة نسبيا من حيث التكلفة سريعة ودقيقة لتقدير حساسية من الجين ونسخة فرة من مجموعة من العينات البيئية، مثل الرواسب الساحلية. استخراج الحمض النووي الأولي هو خطوة حاسمة لضمان عرض تمثيلي من الجراثيم الحاضر المجتمع ويتحقق 22. تحتاج إلى النظر فيها لبروتوكول استخراج عدد من القيود: أ) تحقيق إجمالي تحلل الخلية، ب) المشارك استخراج المركبات المثبطة (على سبيل المثال، الأحماض الدبالية أو polyphenolics)، ج) تلويث الحمض النووي في جزء RNA، د) تدهور السريع في الأحماض النووية المستخرجة عند تخزينها. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة من أجل الالتفاف على هذه القيود. على سبيل المثال، عناية خاصة لابد من اتخاذها لضمان استخلاص الأحماض النووية هو الأمثل لنوع العينة (على سبيل المثال، الرسوبيات والتربة ومياه الصرف الصحي، الخ). تحسينات كبيرة في العائد الحمض النووي والجودة لكل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لا يمكن أن يتحقق من خلال تنفيذ التجارب الأولية 23. للحد من تأثير المركبات المثبطة على التطبيقات القائمة على PCR-24، واختبار مجموعة من التخفيفات من الحمض النووي المستخرج والحمض النووي الريبي. للالتفاف على التدهور السريع في استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي من عدة دورات تجميد ذوبان الجليد وتجنب الخسارة المحتملة للمعلومات الوراثية، وتخزين متعددة قسامات صغيرة الحجم في -80 درجة مئوية. عندما صممت بعناية، QPCR هو وسيلة قوية، تكرار للغاية وحساسة. والجدير بالذكر أن وسائل لتضخيم وبناء منحنى القياسية المبينة في هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأي هدف الجينات في المصالح، بما في ذلك علامات أخرى النشوء والتطور (أي archaeal 16S الريباسي، الفطرية 18S الريباسي) أو الجينات المسؤولة عن وظائف مهمة في البيئة. قيود المعروفة في استخدام QPCR هي: أ) توليد استنساخه عالية الجودة الصورةمنحنى tandard لتقدير المطلق، ب) اختيار التمهيدي / تحقيقات وتعظيم الاستفادة من الظروف فحص ف-PCR، ج) استخدام منخفضة الجودة / المنفصمة الأحماض النووية، د) اختيار التخفيف عمل DNA / RNA لتجنب تثبيط . وعلاوة على ذلك، فإنه لابد من النظر أن QPCR تقنية توفر الكميات المتوفرة من الجينات / نسخة التي قد لا تساوي الخلية تهم: هذا هو الحال بصفة خاصة عندما يتم استهداف الجينات 16S و 18S الريباسي، والكائنات الحية الدقيقة ديها أعداد نسخة مختلفة من الجينات الريباسي في جيناتهم 25. سوف الفقيرة منحنيات معايير الجودة يؤدي إلى تقدير دقيق من الجينات في المصالح. ومن الممارسات الجيدة لتخزين مخزون من معايير عالية التركيز في قسامات صغيرة يمكن من خلالها جعل منحنيات معيار جديدة. لا تخزن المنحنيات القياسية، ودائما التخفيفات جديدة من الأسهم إلى أعلى تركيز في كل مرة. لتقدير دقيق للعينات البيئية ضمان مجموعة من تركيزات ستانمنحنى المعيارية يمتد القيم حزب المحافظين المتوقعة من العينات غير معروف. عندما قياس النصوص، بناء منحنى قياسي من الحمض النووي الريبي لا مضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. عندما يكون ذلك ممكنا، يجب أن تكتمل الكمي للعينات لمقارنة مباشرة في فحص واحد لتجنب بين فحص التباين 20. قد لا يكون هذا ممكنا دائما. لذلك، لمقارنة الكميات المتوفرة من الجينات المولدة بين المقايسات فإنه من المستحسن أن يكون عشوائي مجموعة فرعية من عينات النسخ المتماثل بين المقايسات. تشكيلة واسعة من التمهيدي والتحقيق مجموعات متاحة للQPCR تستهدف الأنواع الميكروبية والمجموعات الوظيفية وهناك حاجة 15. دراسة متأنية عند اختيار هذه لضمان كل من التغطية القصوى وخصوصية للمجموعة المستهدفة حاليا. اذا كانت كفاءة رد فعل من فحص QPCR ليست مرضية، ويبدأ استكشاف الأخطاء وإصلاحها مع اختبار مختلف الظروف الدراجات الحرارية (كما زمنية الصلب و / أو درجة الحرارة) و / أو ظروف التفاعل، على سبيل المثال، تركيزات التمهيدي مسبار متفاوتة. Oالامتحانات التنافسية الوطنية هي الأمثل للمقايسة ورد فعل الظروف ف-PCR، دائما إجراء اختبار أولي لمجموعة من التخفيفات DNA / كدنا] لتحديد تركيز القالب المناسب. حدد نطاق التخفيف مما أدى إلى أكبر عدد نسخة في التخفيف القالب الأمثل لمزيد من الفحوص. حاليا، تقنيات التسلسل الجيل المقبل من تسليط الضوء على كفاءة بنية المجتمع الميكروبي وظائف في عدد كبير من البيئات 26،27،28. ومع ذلك، غالبا ما تقوم هذه المجموعات على نقطة النهاية المكتبات amplicon PCR، وبالتالي لا توفر سوى تقديرات شبه الكمية من وفرة الأنواع معين. وبالتالي، فإن القدرة في الوقت الحقيقي تقنية PCR القائم لاستهداف علامات تصنيفية معينة (من مجال العالي وصولا الى مستوى سلالة) يسمح التحقق من صحة الفعال للنتائج التي حصل عليها الجيل المقبل من التسلسل. وعلاوة على ذلك، تم استخدام QPCR بنجاح في تركيبة مع البيئة الميكروبية أساليب أخرى الجزيئية مثل ايزو مستقرتوب التحقيق (SIP) أو المجهرية النشوء والتطور / وظيفية. جنبا إلى جنب مع أداة السابقة، QPCR يمكن استخدامها لقياس مجتمع نشط أيضي 29،30. عندما جنبا إلى جنب مع تحليل ميكروأري، يوفر QPCR التفسير الكمي الرئيسي من المسوح علامة والجينات الوظيفية النشوء والتطور من بيئات 31،32. لذلك، سواء كان استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع (غالبا على أساس عملية) التقييمات الأخرى من وظيفة النظام الإيكولوجي، الكمي PCR هو أداة أساسية لعلماء البيئة الميكروبية في استكشاف ارتباط بعيد المنال بين المجتمعات الميكروبية وظائف النظم الإيكولوجية.

الكائنات الدقيقة هي حجر الزاوية وظيفة المحيط الحيوي القيادة النظام البيئي. لا تزال غالبية الكائنات الحية الدقيقة جاهل 1. لذلك النهج الجزيئية أساس أساسية لتعميق فهمنا للتنوع وظيفة من الكائنات الحية الدقيقة في البيئة. الوسطى إلى هذه الأساليب هو استخراج الأحماض النووية من العينات البيئية والتضخيم لاحق من الجينات المستهدفة باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وتهدف الخطوة الأولى لاستخراج DNA / RNA إلى ليز جدران الخلايا من الجراثيم الحاضر المجتمع، وإزالة جزيئات نوكليك حمض غير غير مرغوب فيها (المواد على سبيل المثال، العضوية وغير العضوية) والاحتفاظ DNA / RNA في حل لمزيد من التحليل المصب. من بين العديد من الخيارات المتاحة في الأدب 2،3،4،5، بما في ذلك مجموعة من مجموعات استخراج التجارية، وطريقة غريفيث 6 واستخدمت على نطاق واسع 7،8،9. فمن فعالة من حيث التكلفة والسلطة الفلسطينيةrticularly مناسبة تماما لالرواسب كما أنه يستخدم خطوة بفوزه على حبة لليز الخلايا ويتضمن خطوات للحد من شارك في استخراج مثبطات PCR، مثل الأحماض الدبالية، بينما يتعافى في وقت واحد DNA و RNA. يستخدم الخطوة الثانية في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم الجينات المستهدفة، مثل علامة التصنيفية 16S الريباسي، من الأحماض النووية المستخرجة. هذا النهج لديه ويستمر لتسهيل استكشاف uncharacterized الميكروبي 10،11 الصندوق الأسود. ومع ذلك، وأساليب نقطة النهاية PCR القائم تعاني من القيود المختلفة التي يمكن التحيز توصيف المجتمعات الميكروبية 12. لتحديد بدقة وفرة جين / نسخة، في الوقت الحقيقي PCR، المعروف أيضا باسم PCR الكمي (QPCR) يجب أن تستخدم. QPCR يستغل أنظمة صبغ مراسل الفلورسنت التي تتبع تراكم amplicon بعد كل دورة من PCR. وهذا أمر مهم لأنه يعني أنه يمكن أن يحدث الكمي خلال المرحلة الأسي في وقت مبكر، بدلامن نقطة النهاية، مرحلة رد الفعل PCR، عندما العائد amplicon لا يزال يتناسب طرديا مع وفرة الأولى من الجين المستهدف. تستخدم نظامين مراسل عادة: والإقحام الحمض النووي وصمة عار 13 و 5 النشاط &#39;3&#39; نوكلياز خارجية من الحمض النووي بوليميريز 14. منذ النظام السابق مراسل يربط indistinctively لجميع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل، فإنه قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير تسلسل الهدف إذا amplicons غير محددة غير المرغوب فيها أو dimers التمهيدي من المنتجات تحدث. من أجل الالتفاف على هذا، قد تكون هناك حاجة تطويري مكثف من التضخيم. في النظام الأخير، يتم تعقب قالب التضخيم باستخدام مزيج من النشاط 5 &quot;نوكلياز من البلمرة طق أن يشق على fluorophore من التحقيق الداخلي. هذه الميزة تزيد من خصوصية الفحص بسبب استخدام مسبار الفلورة الذي يربط فقط على التكميلية sequenc هدف محددالبريد بين الزوج التمهيدي. مع كل كيمياء يتحقق الكمي من خلال تحديد نقطة عبور (حزب المحافظين) حيث تراكم amplicons PCR، مقاسا زيادة في مضان، هو أعلى بكثير مضان الخلفية. وقد استخدم QPCR نطاق واسع في البيئة الميكروبية لتحديد الكميات المتوفرة من الجينات في بيئات مختلفة 15. وعلاوة على ذلك، يتم الجمع بين النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي إلى [كدنا مع QPCR وRT-QPCR لقياس التعبير الجيني. وبالتالي، QPCR وRT-QPCR تمثل وطرق سريعة فعالة لتقدير أعداد الجينات و / أو نص في العينات البيئية. الكائنات الدقيقة في رسوبيات الساحلية بالسيارة عمليات النظم الإيكولوجية المختلفة، بما في ذلك تمعدن من المواد العضوية، وتدهور الملوثات والدراجات البيولوجية الكيميائية من المواد الغذائية الرئيسية مثل 16،17،18 النيتروجين. فهم شامل لهذه التحولات يتطلب محاسبات شاملر من المساهمة السكان الميكروبية، بما في ذلك البيانات الكمية عن الجين ونسخة فرة. ونقدم لك هنا مجموعة من البروتوكولات اختبارها بدقة، مبسطة وموحدة لتقدير حجم البكتيرية الجين ونسخة فرة 16S الريباسي في الرواسب الساحلية. يحدد البروتوكول جمع العينات، الحمض النووي في وقت واحد واستخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد رنا خالية من الحمض النووي، وفحص الجودة من الأحماض النووية المستخرجة، وتوليد 16S الريباسي الحمض النووي والمعايير -RNA النوعي والكمي للعينات البيئية. وهناك حاجة إلى البيانات الكمية المستمدة من الأساليب المذكورة هنا لتسليط الضوء على المجتمعات الميكروبية القيادة النظم الإيكولوجية الساحلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Toxic, open under chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cetrimonium bromide (CTAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td>Irritant, open under chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Equilibrate at pH 8 before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform:Isoamylalcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.06404.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenglycol 6000&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>528877-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Molecular Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix E tubes</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>116914050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNAse&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.985.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureCleanPlus</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-37047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM Easy T Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JM109 competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-37035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-37036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20768.235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-IT DNA HS Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q-33120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-IT RNA HS Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript &#160;kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-84002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous dna-rna extraction from coastal sediments and quantification of 16s rrna genes and transcripts by real-time pcr

في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل المعروف أيضا باسم PCR الكمي (ف-PCR) هو أداة تستخدم على نطاق واسع في البيئة الميكروبية لتحديد الكميات المتوفرة من الجينات في مجموعات تصنيفية وظيفية في العينات البيئية. تستخدم بالاقتران مع الناسخ رد الفعل العكسي (RT-ف-PCR)، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد النصوص الجينات. Q-PCR يجعل من استخدام حساسة للغاية كيمياء كشف الفلورسنت التي تسمح الكمي من amplicons PCR خلال المرحلة الأسية من رد الفعل. لذلك، يتم تجنب التحيز المرتبطة &quot;نقطة النهاية&quot; PCR في الكشف عن المرحلة هضبة تفاعل PCR. بروتوكول لقياس الجينات 16S الريباسي البكتيرية والنصوص من الرواسب الساحلية عبر في الوقت الحقيقي يتم توفير PCR. لأول مرة، وهي طريقة للرئيسين استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الرواسب الساحلية، بما في ذلك الخطوات الإضافية اللازمة لإعداد رنا خالية من الحمض النووي، ويرد. ثانيا، دليل خطوة بخطوة لتقدير حجم الجينات 16S الريباسي والنقويرد anscripts من الأحماض النووية المستخرجة عبر Q-PCR و RT-ف-PCR. هذا يتضمن تفاصيل لبناء الحمض النووي والحمض النووي الريبي مستوى المنحنيات. تدرج الاعتبارات الأساسية لاستخدام فحوصات RT-ف-PCR في البيئة الميكروبية.

<html> استخراج الحمض النووي ذات نوعية جيدة والحمض النووي الريبي من الرواسب هو الخطوة الأولى في تحديد كمية الجينات ونسخة فرة. والناجحة عائدات استخراج واضحة DNA و RNA العصابات كما هو مبين في الشكل رقم 1 لعينة AC، حيث حادة العصابات 23S و 16S الريباسي مرئية بالإضافة إلى الوزن الجزيئي الفرقة عالية الحمض النووي الجيني. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> الشكل 1. الحمض النووي / استخراج الحمض النووي الريبي. النتائج النموذجية من استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي من ثلاث نسخ (ABC) 0.5 غرام الرواسب الساحلية. تم تشغيل 5 ميكرولتر من DNA / RNA على الاغاروز 1.4٪ إلى 85 V لمدة 40 دقيقة. تم استخدام الواسمات الجزيئية في نطاق 10،037-200 مضت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> -together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; إعداد RNA، وهضم الحمض النووي المستخرج من شارك إلزامي. هذا يجب أن يتبعه 16S الريباسي نقطة النهاية PCR من الحمض النووي الريبي للتأكد من أن الحمض النووي قد أزيلت بنجاح. إذا كان الحمض النووي قد أزيلت تماما فقط لوحظ الفرقة في السيطرة الإيجابية. من المهم استخدام كل أنيق وتخفيف 1:10 من الحمض النووي الريبي لضمان مثبطات لا تمنع تشكيل المنتج PCR. يمكن RNA الآن تخضع رد فعل الناسخ العكسي لتحويلها إلى كدنا]. هذا لا يمكن أن يؤديها إما الاشعال الجينات المحددة أو hexamers عشوائي. عادة، ويتم التفاعل في جهاز PCR، وذلك لضمان درجة حرارة الأمثل. ويستخدم هذا كدنا] كقالب في رد فعل QPCR لاحق. وكميا الحمض النووي والحمض النووي الريبي لتحديد تركيز القالب المستخدم في كل رد فعل. ووضع الخطوط العريضة لبروتوكول رد فعل QPCR تستهدف 16S الريباسي الحمض النووي. ل16S الريباسي النصوص استبدال مكعب قياسيRVE وقالب مع كدنا]. كما وكميا عينات غير معروفة ضد منحنى القياسية، لا بد من التأكد من أن المنحنى القياسي هو من نوعية جيدة الشكل 2 يوضح إعداد (A)، والمنحنيات القياسية والتخفيفات الحمض النووي البيئي، (ب)، والتضخيم من المنحنى القياسي والعينات البيئية (C) تحويل المنحنى القياسي لالانحدار الخطي وحساب الأرقام نسخة الجين. عندما مجموعة التخفيف 10 أضعاف على استعداد بشكل صحيح وتضخيم فرق 3.3 دورة بين كل تخفيف معيار ينظر (يستغرق 3.3 دورات لزيادة عشرة أضعاف في قالب 100٪ كفاءة التضخيم) (الشكل 2Bi). والمطلوب المنحنيات واصفات القياسية، بما في ذلك القيم R 2 من 0.99 والكفاءة PCR في نطاق بين 90 و 110٪ (الشكل 2C). من المهم أن يقدم القيم حزب المحافظين من أي سيطرة قالب (NTC) إذا كان موجودا. إذا حدث هذا الانقطاع حزب المحافظين لمعايير والعينات المجهولة 3.3 دورات (&lt;م&gt; أي أضعاف سجل) أعلى من القيمة حزب المحافظين من المجلس الوطني الانتقالي تفرض 20 (الشكل 2Cii). وكميا قالب غير معروف المستخرجة من الحمض النووي الرسوبيات من أنيق، 10 -1، 10 -2 و 10 -3 التخفيفات (B). لم العينة أنيق لا تضخيم، وكانت القيم حزب المحافظين من 10 -1 إلى 10 -3 التخفيفات 24.12، 26.02 و 28.40 على التوالي. وكان المجلس الوطني الانتقالي حزب المحافظين 30.5، وفرضت على قطع NCT من 27.2. تحويل الكميات المتوفرة من الجينات إلى ز -1 أدى الوزن الرطب الرواسب في 2.5 × 10 7 و 7.1 × 10 7 10 -1 و 10 -2 على التوالي لمجموعة التخفيف. وكان 10 -3 تخفيف حزب المحافظين تحت قطع المجلس الوطني الانتقالي، وبالتالي لم يتم استخدام. في هذه الحالة تم اختيار -2 10 كما في تخفيف القالب الأمثل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> الشكل 2. 16S الريباسي الجينات QPCR التضخيم من المعايير والحمض النووي البيئي المستخرجة من الرواسب الساحلية. إعداد (A) ط) مستوى الحمض النووي منحنى والثاني) التخفيفات الحمض النووي البيئي لQPCR التضخيم، (ب) QPCR التضخيم ط) منحنى مستوى الحمض النووي وب) العينات البيئية، مبينة حزب المحافظين لكل عينة. (C) ط) الانحدار الخطي للمنحنى القياسية مع واصفات منحنى القياسية؛ ب) حساب الكميات المتوفرة من الجينات من عينات بيئية. المجلس الوطني الانتقالي: سلبي تحكم قالب <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> CTAB </td><html><td> 5 ز </td></tr><tr><td> ك 2 هبو 4 x3H 2 O </td><td> 2.58 ز </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.1 غرام </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 2.05 ز </td></tr><tr><td> O 2 درهم </td><td> ما يصل الى 100 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 1. إعداد عازلة CTAB فوسفات. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 ز </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 9.35 ز </td></tr><tr><td> O 2 درهم </td><td> ما يصل الى 100 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> ملاحظة: إضافة PEG 6000 ببطء تحت التدفئة المعتدلة والتحريك من 50 مل من درهم 2 O. </td></tr></tbody></table><html> ضمن الصفحات = &quot;1&quot;&gt; الجدول 2. إعداد PEG-كلوريد الصوديوم حل هطول الأمطار. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> RNA مخفف / 01:10 RNA المخفف </td><td> 1.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 10X PCR العازلة </td><td> 5.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> dNTPs 10 ملي </td><td> 1.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 63F التمهيدي إلى الأمام </td><td> 1.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> CAG دول مجلس التعاون الخليجي TAA CAC ATG الجهاز المركزي للمحاسبات GTC </td><td></td></tr><tr><td> 518R التمهيدي العكسي </td><td> 1.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ATT ACC GCG GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> طق البلمرة </td><td> 0.4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> خالية من ريبونوكلياز درهم 2 O </td><td> 40.6 ميكرولتر </td></tr></tbody></table>ه = &quot;1&quot;&gt; الجدول 3. نوعية RNA مزيج الاختيار PCR سيد خالية من الحمض النووي. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 0،5-5 ميكروغرام </td></tr><tr><td> dNTPs 10 ملي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> التمهيدي عكسي 10 ميكرومتر / Hexamers عشوائية 50 ميكرومتر </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> ما يصل الى 13 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 4. [كدنا مزيج رد فعل التوليف أ. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> عازلة 5X </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 ميكرولتر </td><html></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الناسخ العكسي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 5. [كدنا مزيج رد فعل التوليف B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> هدف </td><td> اسم التمهيدي </td><td> تسلسل </td><td> الصلب T (درجة مئوية) </td><td> مرجع </td></tr><tr><td rowspan="3"> البكتيريا 16S الريباسي </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TCY CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> سوزوكي وآخرون 2000 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (التحقيق) </td><td> CTT GTA CAC ACC دول مجلس التعاون الخليجي CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; الجدول 6. التمهيدي وتحقيقات ل16S الريباسي ف-فحص PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> 2X ميكس ماستر </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر) </td><td> 0.8 ميكرولتر </td></tr><tr><td> التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) </td><td> 0.8 ميكرولتر </td></tr><tr><td> مسبار (10 ميكرومتر) </td><td> 0.4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 7.0 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الحجم النهائي </td><td> 19 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 7. في الوقت الحقيقي مزيج تفاعل PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> واصف </td><td> أهمية </td></tr><tr><td> معامل الارتباط (R 2) </td><td> مقياس الخطي من المنحنى القياسي. ومن الناحية المثالية ينبغي أن يكون R 2 = 1. قيمة R 2 = 0،98-0،99 مقبولة. </td></tr><tr><td> المنحدر (α) </td><td> مقياس لكفاءة التفاعل. ومن الناحية المثالية ينبغي أن يكون معادلا ل-3.32. قيمة في نطاق بين -3.58 و -3.1. </td></tr><tr><td> الكفاءة (= 10 (-1 / المنحدر) -1) </td><td> إذا هو 100٪، وقوالب الزوجي بعد كل دورة الحرارية خلال التضخيم الهائل. مجموعة كفاءة جيدة ما بين 90 و 110٪. </td></tr><tr><td> Y الإعتراض (β) </td><td> الحد النظري للكشف عن رد فعل. على الرغم من أن لا تستخدم لتحديد الحساسية رد فعل، فمن المهم عند مقارنة منحنيات مستوى مختلفة لنفس الهدف. </td></tr></tbody></table> الجدول 8. QPCR اصفات رد فعل.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR at JoVE.com

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR (Video) | JoVE

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

الحمض النووي الريبي في وقت واحد استخراج من الرواسب الساحلية والكمي ل16S الجينات الريباسي والنصوص التي في الوقت الحقيقي PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Research

JoVE Journal

Environment

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays (Video) | JoVE

تقرير من خارج الخلية الميكروبية نشاط انزيم في المياه، والتربة، والرواسب باستخدام إنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية فحوصات

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading (Video) | JoVE

التي تحددها المختبر الفوسفور الجريان من بحيرة الرواسب كمقياس للتحميل الفوسفور الداخلية

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples (Video) | JoVE

جل الآلي الحجم التحديد لتحسين نوعية المكتبات تسلسل الجيل المقبل من إعداد من عينات المياه البيئة

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor (Video) | JoVE

تطوير المولدة للكبريتيد الحمأة من الرواسب البحرية والحد من Trichloroethylene في غطاء المفاعل Upflow اللاهوائية الحمأة

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters (Video) | JoVE

وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em&gt; المعوية النيابة.</em&gt; وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge (Video) | JoVE

استخراج المواد الإنشائية خارج الخلية البوليمرية من هوائية حبيبي الحمأة

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life (Video) | JoVE

نظام التعرض تدفق من خلال لتقييم موقوف الرواسب التأثيرات على الحياة المائية

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis (Video) | JoVE

استخراج المبيدات العضوية من البلاستيك الكريات والبلاستيك تحليل نوع

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols (Video) | JoVE

استخراج وتوصيف السطحي من الهباء الجوي

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS (Video) | JoVE

إعداد البايرايت أوثيجينيك من الرواسب الحاملة لغاز الميثان للنظائر في الموقع الكبريت في تحليل استخدام سيمز

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...