Name: intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1Î² Promoter-driven DsRed Reporter Mice at JoVE.com

The authors have no acknowledgements.

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ&#39; טולדו. 1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed הערה: Offspring מופקים על ידי גידול ...

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+innate+immune+response.">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li><li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming:+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms.">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li><li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation:+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane.">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li><li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases.">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li><li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues.">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li><li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immunoimaging--deeper,+bigger,+more+precise,+and+definitively+more+colorful.">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li><li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+biology+in+live+animals:+ready+for+prime+time.">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li><li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events.">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF.">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection.">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression.">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li><li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice.">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li><li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines.">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin.">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo.">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li><li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils.">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li><li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation.">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation.">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice).">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration).">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li><li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening.">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li><li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+proteins:+selling+cytokines+by+the+pound.">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li><li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes.">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production,+survival,+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation.">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופ...

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות 1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם &quot;דרוכים&quot; על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת 2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה 3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה. לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת 5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, 6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה 8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים. התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית 9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק 16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) 17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק 18. בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 + נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus 19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור 20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת 21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת. IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים 22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. &lt;sup&gt; 18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.

<table>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:165px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:139px;">NDC 63323-540-31</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:165px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Lipopolysaccharides</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:165px;">Hospira</td>
			<td style="width:139px;">NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:165px;">LLOYD Laboratory</td>
			<td style="width:139px;">NADA #139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:165px;">Boehringer Ingelheim</td>
			<td style="width:139px;">ANADA 200-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair-removal cream</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A16P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxazolone</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:139px;">127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">U-100 insulin syringe with 28 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">FITC-CM-Dextran, 150 Kda</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">74817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Butterfly infusion set (27 G needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:139px;">387312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCalibur cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellQuest Pro software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph Software</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים 26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מו?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1Î² Promoter-driven DsRed Reporter Mice at JoVE.com

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

The overall goal of this procedure is to present a technology for monitoring the process of neutrophil priming in living animals. This method can help answer the key questions in the immunology field, such as visualization of the behavior and the function of priming the neutrophils in animal models of rarest diseases and disorders. The main advantage of this technique is that it combines three established methodologies, including fluorescent reporters in viral labeling and intravital imaging.Breed heterozygous pIL1-DsRed mice with wild-type C57Black six mice. At three to four weeks, phenotype their pups. For each pup, prepare a 1.5 milliliter tube with 20 microliters of heparin.To collect blood, hold a pup by its neck scruff and pierce the submandibular vein in the cheek pouch using a 5 millimeter lancet. Only a small puncture is needed. Collect three to five drops of blood per tube.After making the collection, be sure to stop the bleeding and observe the animals for 30 minutes before returning them to the animal facility. To each sample tube, add 500 microliters of red blood cell lysing buffer. Then, vortex the tubes, and incubate them for five to 10 minutes on ice.After the incubation, slowly add 400 to 500 microliters of fetal bovine serum under the cell suspensions in each tube. A clear interface should form between the layers. Next, centrifuge the samples at 1, 500 Gs for five minutes to collect cell pellets.Discard the supernatent and resuspend the cells in 200 microliters of complete RPMI-1640 medium. Then, transfer each suspension to a flow cytometry tube and add 20 microliters of freshly made LPS Working Solution to each tube. Incubate the samples for four hours before performing flow cytometry.To begin, anesthetize the mouse with an intraparetoneal injection of an anesthetic cocktail and confirm adequate sedation with a toe pinch test. Next, apply hair removal cream to the dorsal surface of both ears, wipe it off within a minute, and wash the skin with water. Measure the thickness of the ear where the applications were made using a micrometer.Later, return the mouse in its own cage after it has recovered from the anesthesia, and allow the mouse to rest for at least three days before further testing. After three days, reanesthetize the mouse and measure the ear thickness again to make sure it is not irritated. Then, apply 12.5 microliters of 1.25%oxazolone onto each side of the right ear, and apply 12.5 microliters of the acetone olive oil vehicle solution onto each side of the left ear.As always, observe the mouse recover from the anesthesia. 24 hours later, measure the thickness of the ear again under anesthesia to ensure the oxazolone induced skin inflammation has occurred. To begin, transfer 100 microliters of anti-lyse XG monocolonal antibody into a U100 insulin syringe with a 28 gauge needle.Next, anesthetize a treated mouse as previously described. With the mouse abdomen down, apply gentle downward pressure to the skin dorsal and ventral to an eye to partially protrude the eyeball. Then, carefully place the needle, bevel down, approximately 30 degrees to the medial canthus and carefully insert the needle into the retro orbital sinus.The penetration pressure will be relieved when the needle enters the sinus. Then, eject the content and remove the needle quickly. A small amount of bleeding suggests successful injection.Now, immediately apply 1.25%oxazolone and vehicle solution onto the right and left mouse ears as before. Eight hours later, administer a second dose of the same antibody into each mouse. Also, to visualize the blood vessels, retro orbitally administer 100 microliters of fitc dextran.For this procedure, first anesthetize the mouse as before. Then, apply veterinary ointment to the eyes to prevent dryness during imaging. Next, place a glass coverslip at the center of an imaging stage, and secure the edges of the coverslip with tape.Also, add a drop of PVS to the coverslip. Now, position the mouse's ear over the coverslip, dorsal side down. Next, moisten the ventral surface of the mouse ear with a drop of PVS.Then, mount the tip of the ear with a glass slide on top and secure the slide with tape. Now, turn on a multi laser fluorescence confocal microscope and the related equipment. Turn off the room lights to minimize ambient light exposure.Then, record three dimensional images using the confocal microscope. For time lapse imaging experiments, record three dimensional images every two to four minutes for up to eight hours. All the while, watch for twitching whiskers, which indicates that the mouse is beginning to recover from the anesthesia.In such situations, administer five to 10 microliters of a half dose of anesthetic cocktail via a butterfly needle. pIL-1-DsRed mice were screened for phenotypic DsRed fluorescence produced in peripheral blood leukocytes via flow cytometry. Circulating myeloid cells from wild-type mice minimally express DsRed, while the same cells from pIL1-DsRed mice express distinguishable DsRed signals.IL-1 beta promoter activation is a marker of neutrophil priming, and can be best visualized in living pIL-1DsRed mice. Next, a skin sensitizer, oxazolone, was topically applied to the right ear. Later, the neutrophils were labeled before and after a second application of the oxazolone sensitizer via retro orbital injection.Likewise, fitc dextran was injected to locate blood vessels. Many double labeled cells were found in the extravascular space, which represent primed neutrophils. A small number of cells were only labeled by the lyse XG antibody, which were probably resting neutrophils.Moreover, a small population of DsRed positive cells were observed, which may comprise inflammatory monocytes and activated macrophage. Cell migratory paths were tracked to compare the two neutrophil populations. Both neutrophil populations showed a random migration once the extracellular space had been entered.Interestingly, the putatively primed neutrophils exhibited a significantly higher velocity compared with their putatively resting counterparts. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of immunology. Two explore the behavior and the function of many immune cells in various inflammatory states involving different t-cells.After watching this video, you should have a good understanding of how to monitor the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...