Name: modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00
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We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12 세포 배양 <ol><li> 성장 배지에서 100mm 플레이트 C2C12 마우스 근육 아세포를 유지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 20 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민. 60 % 합류 - C2C12 계대 세포는 약 50이 될 수 있습니다. </li><li> 성장 배지를 버리고 3 ㎖을 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 C2C12 세포를 세척 하였다. PBS를 제거하고 세포를 분리하기 위해 500 ㎕를 0....

<ol>
	<li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).</li><li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies.">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li><li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy:+expansion+of+a+trinucleotide+(CTG)+repeat+at+the+3'+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member.">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li><li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1:+Back+to+the+basics.">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li><li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing.">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li><li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. 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M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li><li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity.">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation.">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li><li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+(DM)+mutation+in+a+cell+culture+model.">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li><li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(CTG)n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line:+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy.">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy.">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li><li>Emerson, C. P., Sweeney, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1.">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li></ol>

C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3&#39;-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 ?...

근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 &#39;비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3&#39;-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다. 우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11965-084</td>
			<td style="width:325px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S11150</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">10378-016</td>
			<td>for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin from bovine pancreas</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">I6634-100MG</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">equine serum</td>
			<td style="width:112px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:151px;">S12150</td>
			<td>for differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE&#160;HD&#160;Transfection Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">E2311&#160;</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">G418 sulfate&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gold Biotechnology&#160;</td>
			<td style="width:151px;">G-418-10</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">sc-108071</td>
			<td>for drug resistant selection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0323BOX</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP00061</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m</td>
			<td style="width:112px;">GE healthcare life science</td>
			<td style="width:151px;">10600015</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MF 20</td>
			<td style="width:112px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:151px;">MF 20</td>
			<td>primary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">T-862</td>
			<td>secondary Ab for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">One step qRT-PCR MasterMix</td>
			<td style="width:112px;">AnaSpec</td>
			<td style="width:151px;">05-QPRT-032X</td>
			<td>for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11667165001</td>
			<td>for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CUG-BP1 Antibody (3B1)</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-20003</td>
			<td>primary Ab western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Actin Antibody</td>
			<td style="width:112px;">santa cruz</td>
			<td style="width:151px;">sc-1615</td>
			<td>goat polyclonal IgG for loading control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">293T Ecopack</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">631507</td>
			<td>cells for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pMSCV-puro</td>
			<td style="width:112px;">Clontech</td>
			<td style="width:151px;">634401</td>
			<td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMSCV-Celf1Flag-puro</td>
			<td style="width:112px;">house-constructed</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">psPAX2</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:112px;">gift from Didier Trono</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>for lentivirus preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP-CUG5</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GFP- CUG200</td>
			<td style="width:112px;">gift from M.S. Mahadevan</td>
			<td style="width:151px;">not available</td>
			<td>details in reference 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P6148</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TWEEN&#160;20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P9416</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D9542</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히​​ 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.

C2C12 세포는 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200로 형질했다. 약제 내성의 선택 후, 안정한 풀을 GFP 발현 (도 1a)에 의해 시각화 될 수있는 확립 하였다. 차별화 된 근육 아세포에서 Myotube 형성은 10 (그림 1B)를 면역 염색 중쇄를 미오신에 의해 검출되었다. myotube 형성의 정량은 융합 지수는 2.6 ± 1.1 %로 35.4 ± 4.1 %로 감소하고, myotube 영역이 GFP-CUG200 (그?...

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Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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