Name: screening for functional non-coding genetic variants using electrophoretic mobility shift assay (emsa) and dna-affinity precipitation assay (dapa)
Uploaded: 2016-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA at JoVE.com

We thank Erin Zoller, Jessica Bene, and Lindsey Hays for input and direction in protocol development. MTW was supported in part by NIH R21 HG008186 and a Trustee Award grant from the Cincinnati Children's Hospital Research Foundation. ZHP was supported in part by T32 GM063483-13.

1. הכנת פתרונות ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין בדיקות oligonucleotide DNA מותאמות אישית לשימוש Emsa ו DAPA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית חלבון הלא ספציפית מחייב, לעצב oligos קצר (בין 35-45 זוגות בסיסים (bp) אורך) 30, ומנ...

<ol>
	<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits.">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li><li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA.">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li><li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+noncoding+genetic+variation+in+complex+traits+and+human+disease.">Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease.</a> Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).</li><li>Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interpretation+of+non-coding+sequence+variation:+concepts+and+challenges.">Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges.</a> Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).</li><li>Zhang, F., Lupski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+genetic+variants+in+human+disease.">Non-coding genetic variants in human disease.</a> Hum Mol Genet. , (2015).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+disequilibrium--understanding+the+evolutionary+past+and+mapping+the+medical+future.">Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future.</a> Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).</li><li>Bush, W. S., Moore, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+Genome-wide+association+studies.">Chapter 11: Genome-wide association studies.</a> PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822 (2012).</li><li>1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+map+of+genetic+variation+from+1,092+human+genomes.">An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.</a> Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).</li><li>Chang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+PLINK:+rising+to+the+challenge+of+larger+and+richer+datasets.">Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets.</a> Gigascience. 4, 7 (2015).</li><li>Purcell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLINK:+a+tool+set+for+whole-genome+association+and+population-based+linkage+analyses.">PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.</a> Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).</li><li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Crawford, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+DNase+hypersensitive+sites+using+massively+parallel+signature+sequencing+(MPSS).">Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS).</a> Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+genome+browser+at+UCSC.">The human genome browser at UCSC.</a> Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).</li><li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes.">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li><li>Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLUEPRINT:+mapping+human+blood+cell+epigenomes.">BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes.</a> Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cistrome:+an+integrative+platform+for+transcriptional+regulation+studies.">Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies.</a> Genome Biol. 12 (8), R83 (2011).</li><li>Griffon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+public+ChIP-seq+experiments+reveals+a+complex+multi-cell+regulatory+landscape.">Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e27 (2015).</li><li>Staudt, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lymphoid-specific+protein+binding+to+the+octamer+motif+of+immunoglobulin+genes.">A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes.</a> Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).</li><li>Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+factor+that+binds+to+a+conserved+sequence+motif+in+transcriptional+control+elements+of+immunoglobulin+genes.">A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes.</a> Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).</li><li>Weirauch, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+inference+of+eukaryotic+transcription+factor+sequence+specificity.">Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity.</a> Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).</li><li>Ward, L. D., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaploReg:+a+resource+for+exploring+chromatin+states,+conservation,+and+regulatory+motif+alterations+within+sets+of+genetically+linked+variants.">HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants.</a> Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).</li><li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotation+of+functional+variation+in+personal+genomes+using+RegulomeDB.">Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB.</a> Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).</li><li>Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniPROBE,+update+2015:+new+tools+and+content+for+the+online+database+of+protein-binding+microarray+data+on+protein-DNA+interactions.">UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).</li><li>Mathelier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JASPAR+2014:+an+extensively+expanded+and+updated+open-access+database+of+transcription+factor+binding+profiles.">JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).</li><li>Smith, M. F., Delbary-Gossart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).</li><li>Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cellular+proteins+recognizing+the+HIV+enhancer+using+a+microscale+DNA-affinity+precipitation+assay.">Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay.</a> Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).</li><li>. BCA Protein Assay Kit: User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2014)</li><li>Wijeratne, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+separation+using+radially+aligned+titania+nanotubes+on+titanium+wire.">Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fastest+Western+in+Town:+A+Contemporary+Twist+on+the+Classic+Western+Blot+Analysis.">The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupus+Risk+Variant+Increases+pSTAT1+Binding+and+Decreases+ETS1+Expression.">Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression.</a> Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).</li><li>Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+roles+of+Stat1+in+regulating+gene+expression.">Complex roles of Stat1 in regulating gene expression.</a> Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).</li><li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA)+for+the+Study+of+RNA-Protein+Interactions:+The+IRE/IRP+Example.">Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example.</a> J. Vis. Exp. (94), e52230 (2014).</li><li>Heng, T. S., Painter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+The+Immunological+Genome+Project:+networks+of+gene+expression+in+immune+cells.">Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells.</a> Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGPS:+an+extensible+and+customizable+portal+for+querying+and+organizing+gene+annotation+resources.">BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources.</a> Genome Biol. 10 (11), R130 (2009).</li><li>Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGPS+and+MyGene.info:+organizing+online,+gene-centric+information.">BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+features+and+chromatin+structure+around+the+genomic+regions+bound+by+119+human+transcription+factors.">Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors.</a> Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).</li><li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay.">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li><li>Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osr1+acts+downstream+of+and+interacts+synergistically+with+Six2+to+maintain+nephron+progenitor+cells+during+kidney+organogenesis.">Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis.</a> Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).</li><li>Yang, T. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genevar:+a+database+and+Java+application+for+the+analysis+and+visualization+of+SNP-gene+associations+in+eQTL+studies.">Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).</li><li>Fort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liver+enhancer+in+the+fibrinogen+gene+cluster.">A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster.</a> Blood. 117 (1), 276-282 (2011).</li><li>Solberg, N., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+assay+to+study+the+activity+of+a+cloned+promoter+DNA+fragment.">Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment.</a> Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+repressor+element+in+the+5'-untranslated+region+of+human+Pax5+exon+1A.">A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A.</a> Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9.">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

<html> למרות התקדמות בטכנולוגיות רצף גנוטיפ מאוד שפרה את היכולת שלנו לזהות וריאנטים גנטיים הקשורים למחלה, היכולת שלנו להבין את המנגנונים התפקודיים מושפעים הגירסות אלה מפגרת. מקור עיקרי של הבעיה הוא הרבה הגירסות הקשורים למחלות ממוקמות n על-קידוד האזורים בגנום, אשר סביר ?...

סידור מחקרים המבוססים גנוטיפ, כוללים מחקרים אגודים הגנום כולו (GWAS), מחקרי מוקד המועמד, ומחקרי deep-sequencing, זיהו וריאנטים גנטיים רבים הקשורים סטטיסטי עם מחלה, תכונה, או הפנוטיפ. בניגוד לתחזיות המוקדמות, רוב גרסאות אלה (85-93%) נמצאים באזורים ללא קידוד ואל תשנה את רצף החומצות האמיניות של חלבונים 1,2. פירוש הפונקציה של הגירסות ללא קידוד אלה וקביעת המנגנונים הביולוגיים חיבורם המחלה הקשורה, תכונה, או הפנוטיפ הוכיח מאתגרת 3-6. פיתחנו אסטרטגיה כללית לזהות את המנגנונים המולקולריים המקשרים גרסאות כדי פנוטיפ ביניים חשוב - ביטוי גנים. צינור זה הוא תוכנן במיוחד כדי לזהות אפנון של TF המחייבת וריאנטים גנטיים. אסטרטגיה זו משלבת גישות חישוביות וטכניקות ביולוגיה מולקולרית שמטרתו לחזותהשפעות ביולוגיות של וריאנטים מועמד סיליקון, ולאמת תחזיות אלו באופן אמפירי (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54093/54093fig1.jpg" /> איור 1:.. גישה אסטרטגית לניתוח וריאנטים גנטיים ללא קידוד צעדים שאינם כלולים בפרוטוקול מפורט הקשורים כתב היד הזה מוצללות באפור <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54093/54093fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> במקרים רבים, חשוב להתחיל על ידי הרחבת הרשימה של וריאנטים לכלול את כל אלה-איזון הצמדה גבוה (LD) עם כל גרסה קשורה מבחינה סטטיסטית. LD הוא מדד של העמותה הלא אקראית של אללים בשתי עמדות כרומוזומליות שונות, אשר ניתן למדוד על ידי נתון r 2 7. r 2 הוא מדד של ליןKage חוסר שיווי משקל בין שתי גרסאות, עם r 2 = 1 המציין הצמדה מושלמת בין שתי גרסאות. אללים ב LD הגבוהה נמצאים לשתף להפריד בכרומוזום פני אוכלוסיות אבות. מערכי genotyping נוכחיים אינם כוללים את כל הסוגים הידועים בגנום האנושי. במקום זאת, הם מנצלים את LD בתוך הגנום האנושי וכוללים משנה של הסוגים הידועים אשר פועלים פרוקסי עבור הגירסות אחרות בתוך אזור מסוים של LD 8. לפיכך, גרסה ללא כל תוצאה ביולוגית עשויה להיות קשורה למחלה מסוימת משום שהיא נמצאת LD עם וריאנט-סיבתית גרסה עם השפעה ביולוגית משמעותית. עניינים טכניים, מומלץ להמיר את המהדורה האחרונה של 1,000 הגנום להקרין 9 קבצים שיחת וריאנט (vcf) לתוך קבצים בינאריים תואמים עמד לירות 10,11, כלי קוד פתוח לניתוח עמותה הגנום כולו. בהמשך לכך, כל וריאנטים גנטיים אחרים עם LD r 2&gt; 0.8 עם כל va קלט גנטיriant ניתן לזהות כמועמדים. חשוב להשתמש אוכלוסיית ההתייחסות המתאימה למשל החורג הזה, אם גרסה זוהתה במקצועות ממוצא אירופאי, נתונים הנבדקים ממוצא דומה אמורים לשמש להרחבת LD. הרחבת LD לעתים קרובות תוצאות בעשרות גרסאות המועמד, וסביר להניח כי רק חלק קטן של אלה תורמים מנגנון המחלה. לעתים קרובות, זה מעשי לבחון כל הניסיון של הגירסות אלה בנפרד. לכן כדאי לנצל את אלף מערכי נתונים גנומי פונקציונליים בפומבי זמינים כמסנן לתעדף את הווריאציות. לדוגמה, הקונסורציום ENCODE 12 ביצע אלפי ניסויים שבב seq המתאר את עקדת TFS ושיתוף גורמים, וסימני היסטון במגוון רחב של הקשרים, יחד עם נתונים נגישות הכרומטין מטכנולוגיות כגון DNase-seq 13, ATAC -seq 14, ו -15 פייר-seq. Databases ושירת אינטרנט כגון דפדפן הגנום UCSC 16, מפת הדרכים epigenomics 17, Blueprint Epigenome 18, Cistrome 19, ולמפות 20 לספק גישה חופשית לנתונים המיוצרים על ידי אלה הניסיונות בטכניקות אחרות על פני מגוון רחב של סוגי תאים ותנאים. כאשר ישנן גרסות רבות מכדי לבחון באופן ניסיוני, נתונים אלה יכולים לשמש כדי לתעדף אלה הממוקמים בתוך אזורי רגולטוריים סבירים בסוגי תאים ורקמות רלוונטיים. יתר על כן, במקרים בהם קיימת גרסה נמצא במרחק שיא שבב seq עבור חלבון מסוים, נתונים אלה יכולים לספק מוביל פוטנציאל כמו ל TF ספציפי (ים) או שיתוף גורמים אשר מחייב העשוי להשפיע. בשלב הבא, גרסות עדיפות וכתוצאה מוקרנות באופן ניסיוני כדי לאמת חלבון גנוטיפ תלוי חזה מחייב שימוש Emsa 21,22. Emsa מודד את שינוי ההגירה של אוליגו על ג&#39;ל TBE הלא צמצום. אוליגו שכותרתו fluorescently הוא מודגרות עםlysate הגרעיני, ומחייב גורמים גרעיניים יהיה לעכב את התנועה של אוליגו על הג&#39;ל. באופן זה, אוליגו אשר מחויב יותר גורמים גרעיניים יציגות כמו אות ניאון חזקה על סריקה. יש לציין, Emsa אינה דורשת תחזיות לגבי החלבונים הספציפיים אשר מחייבים יושפע. ברגע הגירסות מזוהות הנמצאות בתוך אזורי רגולטוריים חזה ומסוגלים גורמים גרעיניים מחייבים באופן דיפרנציאלי, שיטות חישוביות מועסקות לחזות את TF (ים) הספציפי אשר מחייב הם עשויים להשפיע. אנחנו מעדיפים להשתמש CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UniProbe 26, ו JASPAR 27. לאחר מועמד TFS מזוהים, תחזיות אלו ניתן לבדוק באופן ספציפי באמצעות נוגדנים נגד TFS אלה (Emsa-supershifts ו DAPA-מערבונים). Emsa-supershift תהיה כרוכה בתוספת של נוגדן TF-ספציפית lysate ו אוליגו גרעיני. תוצאה חיובית של גידול Emsa-supershift הוא represented כמעבר נוסף בלהקה Emsa, או הפסד של הלהקה (הנסקרת תוך התייחסות 28). בשנות ה DAPA משלימים, דופלקס אוליגו-biotinylated 5&#39;המכיל את וריאנט ואת 20 בסיס-זוג איגוף נוקלאוטידים מודגרת עם lysate גרעיני מסוג תא הרלוונטיים (ים) כדי ללכוד כל הגורמים גרעיני כבילת oligos במיוחד. אוליגו המורכב גורם דופלקס-גרעיני הוא משותק על ידי streptavidin microbeads בטור מגנטי. הגורמים גרעיני כבול נאספים ישירות דרך elution 29,48. תחזיות כריכה ניתן להעריך מכן על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון. במקרים בם אין תחזיות ברורות, או תחזיות רבות מדי, elutions מ ומורד למשוך גרסה של ניסויי DAPA ניתן לשלוח גרעין פרוטאומיקה לזהות TFS המועמד באמצעות ספקטרומטר מסה, אשר לאחר מכן ניתן לאמת באמצעות שתואר לעיל אלה שיטות. בשאר של articlדואר, הפרוטוקול המפורט לניתוח Emsa ו DAPA של וריאנטים גנטיים מסופק.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Custom DNA Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl, for CE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>For CE and NE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M), pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R1021</td>
			<td>For CE, NE, and annealing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>NaCl, for NE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BP1756-100</td>
			<td>For annealing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CM</td>
			<td>PBS, for cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646563</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78420</td>
			<td>Prevents dephosphorylation of TFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB01140</td>
			<td>NP-40, for nuclear extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For measuring protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey EMSA Buffer Kit</td>
			<td>Licor</td>
			<td>829-07910</td>
			<td>Contains all necessary EMSA buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Gels, 6%, 12 Wells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For EMSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B52</td>
			<td>For EMSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FactorFinder Starting Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-318</td>
			<td>Contains all necessary DAPA buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licor Odyssey CLx</td>
			<td>Licor</td>
			<td></td>
			<td>Recommended scanner for DAPA/EMSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Fungizone&#174; Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>FBS, for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22400-071</td>
			<td>Contains L-glutamine and 25mM HEPES</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for functional non-coding genetic variants using electrophoretic mobility shift assay (emsa) and dna-affinity precipitation assay (dapa)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

בסעיף זה, תוצאות נציגים למה לצפות ניתנות בעת ביצוע Emsa או DAPA, ואת ההשתנות לגבי איכות lysate מאופיינת. לדוגמא, הוצע כי הקפאת דגימות חלבון הפשרה מספר פעמים עלולה לגרום denaturation. על מנת לחקור את שחזור של ניתוח Emsa בהקשר של אלה &quot;להקפיא להפשיר&quot; מחזורים, שני 35 ...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA at JoVE.com

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Light/dark Transition Test for Mice

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Elevated Plus Maze for Mice

מבוך פלוס גבוהות עבור עכברים

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...