Name: stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates at JoVE.com

Bu çalışma ödeneği başlatın NUS tarafından (R-397-000-192-133) ve ETPL Gap Fonu (R-397-000-198-592) desteklenir. GS NUS Araştırma bilginidir. Yazarlar, hücre micropatterning onu teknik destek için Dr. Jiangwa Xing teşekkür etmek istiyorum.

NOT: Bu protokol PDMS şablon kullanarak HESC hattının lazer kesim ve micropatterning, H9 tarafından 1000 mikron desenleri ile PDMS şablonun yapımını anlatmaktadır. 1. Tasarım ve micropatterning için PDMS şablonun Fabrikasyon <ol><li> İstenilen geometri ve boyut (örneğin, 1,000 mikron daireler) ve bilgisayar destekli tasarım yazılımı 10 kullanarak şablon conta geçiş delikleri ile stenciling sayfasını tasarlayın. </li><li> 120-150 mikron ve kalın...

<ol>
	<li>Graf, T., Stadtfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Heterogeneity of embryonic and adult stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).</li><li>Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+research+and+therapy.">The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).</li><li>Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stem+cell+fate+by+physical+interactions+with+the+extracellular+matrix.">Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).</li><li>Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+nanotopography+and+integrin-matrix+interactions+to+influence+stem+cell+fate.">Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate.</a> Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).</li><li>Joddar, B., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+substrates+for+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+cultures.">Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures.</a> J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li><li>Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+human+embryonic+stem+cells+dissects+the+mesoderm+and+endoderm+lineages.">Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages.</a> Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).</li><li>Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+WNT5a+and+WNT11.">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li><li>Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+integrin+and+E-cadherin-mediated+adhesions+to+spatially+control+heterogeneity+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 50, 87-97 (2015).</li><li>Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+human+teratogen+detection+by+geometrically+confined+cell+differentiation+and+migration.">A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration.</a> Sci Rep. 5, 10038 (2015).</li><li>Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays.">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates.">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+microwell+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">3-D microwell culture of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).</li><li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+microscaled+multilayered+colonies+leading+to+enhanced+homogeneity+and+maturation.">Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation.</a> Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).</li><li>Mei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells.">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).</li><li>Melkoumian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptide-acrylate+surfaces+for+long-term+self-renewal+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).</li><li>Carter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptotactic+islands:+a+method+of+confining+single+cells+to+study+individual+cell+reactions+and+clone+formation.">Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation.</a> Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).</li><li>Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+intracellular+calcium+and+electrical+activity+from+patterned+neural+networks+in+culture.">Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).</li><li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Jinno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+multilayer+parylene-C+stencils+for+the+generation+of+patterned+dynamic+co-cultures.">Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures.</a> J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off.">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).</li><li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures.">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation.">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).</li><li>Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+neural+stem+cells+and+Purkinje+neurons+using+a+polydimethylsiloxane+(PDMS)+stencil.">Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil.</a> Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroArray:+a+universal+interface+for+patterning+and+interrogating+neural+circuitry+with+single+cell+resolution.">NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution.</a> Sci Rep. 4, 4784 (2014).</li><li>Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polydimethylsiloxane+Microstencils+Molded+on+3-D-Printed+Templates.">Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates.</a> J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve.">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).</li><li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+properties+of+the+cell+dictate+stress-induced+spreading+and+differentiation+in+embryonic+stem+cells.">Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells.</a> Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues.">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123, 4201-4213 (2010).</li><li>Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+stiffness+on+early+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation.</a> J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).</li></ol>

Micropatterning şablon imalatı Elek micropatterning niş aracılı farklılaşma model oluşturmanın araştırmak için hPSC micropatterns oluşturmak için ideal bir yöntem sağlar. Böyle microcontact baskı ve photopatterning gibi diğer micropatterning teknikleri üzerinde şablon desen önemli avantajı, yüzey modifikasyonu gerektirmez ve geleneksel TCPS yüzeylerde uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, farklı hPSC hatları için optimize edilmiş kült?...

Embriyonik kök hücreler (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), yaygın olarak tüm hücre soyları halinde nedeniyle farklılaşma potansiyeli, normal ve hastalıklı organogenez deneysel modelleme gibi rejeneratif tıpta istismar üç germ katmanları 1,2. HPSCs farklılaşması kaderi fiziksel ipuçları 3-5 aracılık ettiği otokrin veya 1 sinyal parakrin yanı sıra mechanotransduction süreçleri modüle yerel çevresel faktörlere karşı oldukça duyarlıdır. Hücre micropatterning mekansal, hücre-hücre etkileşimleri 6 ve hücre-matris etkileşimlerinin 3 gibi, yerel hücresel mikro-kontrol etmek için bir araç olarak bir hücre popülasyonunun geometrisi ve konumu düzenlemek için geliştirilmiş tekniklerin bir dizi kapsar. hPSCs bağlamında, hücre micropatterning niş bağlıdır nasıl hakkında önemli bilgiler elde etmek için istihdam edilmiştirKBB otokrin sinyalizasyon erken embriyonik farklılaşma kalıpları 6 içine HESC Pluripotency-farklılaşma kararları 7 ve organizasyon düzenler. 2D ve 3D micropatterned hPSCs sırayla üç germ 8,9 içine farklılaşma kararları etkilemiş çok hücreli desen, koloni boyutunu denetlemek için kullanılmıştır. Bu integrin E-kadherin karışma hücre kaderi heterojen 10 çıkmasına neden olabilir araştırmak üzere bir hPSC koloni içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin ölçüde modüle edilmesi için çok-hPSC micropatterns kullanmışlardır. Doku veya organ gelişimi sırasında büyüme faktörleri ve hormonların etkisini araştırmak için gelişimsel hastalıklar 11, ilaç toksisitesi taraması için deneysel model olarak hPSCs ve çok hücreli micropatterns uygulanması yönünde yukarıdaki raporlar açık yeni caddeleri gösteriler ve oluşumunu çözülmeye doku desenleri. Hücre micropatter bir sayısızFalconnet diğerleri tarafından gözden olarak ning teknikler geliştirilmiştir. ark. 12 ancak böyle mikro temas 7,8,13 yazdırma gibi sadece bir avuç, Mikro kültürü 14,15, photopatterning 6 ve microstencils 16 başarıyla hPSCs ile hayata geçirilmiştir. micropatterning hPSCs Challenge etkilenmeleri ve hücre eki ve hayatta kalma için spesifik hücre dışı matris (ECM) ve büyüme koşullarının sıkı bir gereksinimi bulunmaktadır. 2D hPSC kalıpları için, mikro-kontak baskı doku kültürü ve cam yüzeylerde 13 hPSC micropatterns oluşturmak için en yaygın yöntemlerden biridir. yöntem, Matrigel olarak laminin ve bazal zar matris, aşağıdakileri içeren hPSC kültür, kullanılan model yaygın ECM için kullanılabilir. Bununla birlikte, tipik olarak poli-D-lizin ile destekli iki aşamalı bir kaplama işlemini gerektirir ve hPSCs 6,13 üzerine takmak için stabil ECM micropatterns yapmak için özel bir atıl atmosfer ve nem koşulları ihtiyacı. Her micropatterning yönteminin en önemli husus çevreleyen bölgelere belirsiz hücre eki en aza indirirken yüzey modifikasyonu rejimi istenilen geometrik çözünürlükte hPSC yapışkanlı ECM desenleri üretebilir olup olmadığıdır. Burada, hPSCs üzerinde takmak için önce yapışkan ECM desen nesil ek yüzey modifikasyon adımlar olmadan hPSC micropatterns oluşturmak için basit bir yöntem olarak şablon micropatterning kullandığını rapor etmiştir. Hücre şablonun içinden delikler fiziksel ECM kaplamalar ve daha sonra ekilmiş hPSCs içeren bir hücre kültür substrat üzerine sızdırmaz boyutu milimetre mikron olan ince bir zar, örneğin, polidimetilsiloksan (PDMS) tabakanın içerir. şablon desenlendirme fiziksel hPSC yatan ECM kaplı yüzeye doğrudan erişim ve ekleyebilirsiniz konumu frenleyici çalışır gibi, bu yöntem hPSC kültürleri destekleyen çeşitli yüzeylerde ile uyumludur. sadece requiremenT Şablon malzeme seçimi alt-tabaka ile bir tersinir bir yalıtım oluşturmak olabilir. Bu alt-tabakalar, geleneksel doku kültür polistiren (TCPS) 17, ligand konjuge tabakaları 18, hem de ayarlanabilir sertlik elastomer tabakaları kapsar (örn., PDMS) 19. Bu yöntem, aynı zamanda, uygun bağlanma ve hPSCs farklılaşması için izin verilmesi için, vitronektin (veya VTN protein), laminin ve bazal membran matris (örneğin, Matrigel ve Geltrax) gibi farklı ECM&#39;nin kaplama sağlar. Belirli hPSC hattı Bu nedenle, optimum aktarım için ECM alt-tabaka konfigürasyonları uygun hücre-matris yapışma, hayatta kalma ve farklılaşması için micropatterning şablona. Son zamanlarda, benzer bir yöntem, aynı zamanda, poli (metil metakrilat) ile micropatterning HESC (PMMA), mikro-Şablon dizileri 16 hepatik farklılaşma doğrudan bildirilmiştir. Hücre şablonlar, farklı malzemelerden imal edilebilir araya dahilALS 20,21, poli (p-ksilen) polimerler 22,23, PMMA 16 ve en çok PDMS 24-28. Silisyum ve poli (p-ksilen) polimerler şablonlar biyolojik kullanıcılara kendi sınırları erişilebilirlik özel ekipman 20-23 ile geçiş delikleri doğrudan aşındırma gerektirir. PDMS şablonlar tipik olarak 3 um 2,000 um 11,26-29 aralığındadır istenen bir özellik boyutuna bağlı olarak farklı yöntemler ile imal edilebilir. Küçük özellikler istenirse, ince stenciling levhalar micropatterns 28 kabartmaları içeren bir microfabricated silikon şablona basın kalıplama PDMS pre-polimer üretilebilir. Özellikler&gt; 1,000 mikron, bir CO2 lazer kesici doğrudan şablon imalat sırasında önceden döküm PDMS kağıda desenleri kesmek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. PDMS şablon geri dönüşümlü da yeterli tutarlılık ile deneylerini yapmak için onları maliyet-etkin hale getirir. <p cl= &quot;Jove_content&quot; eşek&gt; Burada lazer kesim tarafından 1000 mikron özelliklere sahip bir PDMS şablonun imalat ve HESC micropatterns üretimi için detaylı metodoloji sunuyoruz. Bu HESC micropatterns integrinin ölçüde modüle etmek için kullanıldı ve hücre yapışmasının mekansal polarizasyon hücresi kaderi heterojen 10 sonuçlanan araştırmak üzere E-kadherin uyumlu bir HESC koloni içinde yapışıklıklar aracılı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;2 mm thick PDMS sheet</td>
			<td style="width:191px;">Specialty Silicone Products Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">SSPM823-.005</td>
			<td style="width:423px;">Used to form reservoir for stencil</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">120-150 &#956;m thick PDMS sheet</td>
			<td style="width:191px;">Specialty Silicone Products Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">SSPM823-.040</td>
			<td style="width:423px;">Used to form stencil&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm petri dish</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Nunc Nunclon Delta</td>
			<td style="width:119px;">150326</td>
			<td style="width:423px;">Substrate for micropatterning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:191px;">Accutase, Merck Millipore, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">SCR005</td>
			<td style="width:423px;">Enzyme to break H9 Cells into single cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Activin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">338-AC-010</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BMP4&#160;</td>
			<td style="width:191px;">R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">338-BP-010</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasma system&#160;</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Femto Science, Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MP</td>
			<td style="width:423px;">For plasma oxidation of stencil</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">7923</td>
			<td style="width:423px;">Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">GIBCO, USA</td>
			<td style="width:119px;">11330032</td>
			<td style="width:423px;">Basal medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF2</td>
			<td style="width:191px;">&#160;R&#38;D Systems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">233&#8211;FB&#8211;025</td>
			<td style="width:423px;">Growth factor for H9 differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">H9 Cell line</td>
			<td style="width:191px;">WiCell Research Institute, Inc., USA</td>
			<td style="width:119px;">WA09</td>
			<td style="width:423px;">Human embryonic stem cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">hESC-qualified basement membrane matrix</td>
			<td style="width:191px;">Matrigel, BD Biosciences, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td style="width:423px;">Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica Microsystems, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">DMi1</td>
			<td style="width:423px;">For capturing bright-field images</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser cutter</td>
			<td style="width:191px;">Epilog Helix 24 Laser System</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:423px;">Used to generate through holes in PDMS sheet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mTeSR&#8482;1 medium&#160;</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:423px;">Maintainence medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PDMS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SYLGARD&#174; 184, Dow Corning Co., USA</td>
			<td style="width:119px;">3097358-1004</td>
			<td style="width:423px;">Used for sticking the PDMS stencil and reservior</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROCKi Y27632</td>
			<td style="width:191px;">Calbiochem, Merck Millipore, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">688000</td>
			<td style="width:423px;">Maintains H9 cells as single cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">STEMdiff&#8482; APEL&#8482; medium&#160;</td>
			<td style="width:191px;">StemCell&#8482; Technologies, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">5210</td>
			<td style="width:423px;">Differentiation medium for H9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene terephthalate film</td>
			<td style="width:191px;">SureMark Singapore</td>
			<td style="width:119px;">SQ-6633</td>
			<td style="width:423px;">Used to form stencil&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture compatible non-ionic surfactant</td>
			<td style="width:191px;">Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore</td>
			<td style="width:119px;">P2443</td>
			<td style="width:423px;">Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Bu yazıda 1000 mikron özellikleri üretmek için bir lazer kesici kullanarak bir hücre şablonun imalat açıklar. şablon 2 bölümden oluşmaktadır: ince stenciling sayfası geçiş delikleri mikrodesenlerle içeren (kalın yaklaşık 100-200 mikron) ve ECM kaplama çözeltisi veya hücre süspansiyonu içeren bir PDMS conta. Burada, 127 um ve 2 mm kalınlığında, ticari olarak temin PDMS sayfaları, sırasıyla delikli kalıpla baskı tabakası ve conta olarak kullanılmıştır...

Watch this Scientific Journal Video about Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates at JoVE.com

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...