Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

我们感谢达伦 Obbard 为果蝇图像在图3C 和视频手稿;j ·哈德威克, 韦德吉布森和希瑟 m。这项工作由尤德爵士纪念研究金 (H.L.T.)、Dr. (H.L.T.)、富布赖特奖学金 (H.L.T.)、生命科学研究基金会奖学金 (H.L.T.)、K22 CA204458 (H.L.T.) 资助。Shurl 是生命科学研究基金会 (2014-2017) 的库尔奇基金会研究员。

1) CaspaseTracker 生物传感器蝇的制备
<ol><li>麻醉飞行与 CO2, 并使用画笔将7到10酶敏感的 Gal4 (DQVD)19处女母和7到 10 G 跟踪53 Gal4 记者年轻的雄性苍蝇 (反之亦然) 在同一个小瓶中的苍蝇食品和新鲜酵母糊。 注意:交叉的酶敏感 (DQVD) Gal4 和 G 迹蝇将产生 CaspaseTracker 后代苍蝇。跨酶-in 敏感 (DQVA)19 Gal4 和 G 跟踪苍蝇将提供?...

CaspaseTracker 双生物传感器系统是一种新颖和独特的工具, 允许检测最近或正在进行的酶活动, 并跟踪细胞已逆转细胞死亡的过程和生存后, 经历了酶活动在体内。虽然酶活动传统上被认为是细胞凋亡的标志, 但越来越多的研究表明, 非凋亡的酶活性在不同的正常细胞功能中扮演着潜在的角色, 如神经元活动的调节79,80,...

程序性细胞死亡, 如细胞凋亡, 通过在多细胞生物体中消除不需要的、受伤或危险的细胞, 在胚胎发育和正常的稳态中起重要作用1,2,3。细胞死亡和生存之间的平衡丧失可能导致致命的后果, 如癌症, 心力衰竭, 自身免疫和变性4,5,6,7,8。刽子手半的激活传统上被认为是 "没有返回点" 在细胞凋亡9,10,11, 因为它触发快速和大规模的蜂窝拆除12, 13、14、15、16。挑战这一一般教条, 我们证明, 培养的垂死的原细胞和癌细胞不仅可以恢复后酶活化, 而且还遵循重要的细胞死亡标志, 包括细胞膜起泡, 细胞萎缩,线粒体分裂, 线粒体细胞色素c释放到胞, 核和染色质缩合, DNA 损伤, 核分裂, 细胞表面暴露磷脂 (PS), 并形成凋亡体17,18,19,20,21. 我们建议, anastasis 是一种内在的细胞恢复现象, 因为死亡细胞可以恢复后, 细胞死亡的刺激17,18,19,20,21. 我们创造了术语 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 这意味着 "上升到生活" 在希腊, 描述这个意想不到的细胞恢复现象。最近的独立研究进一步支持了我们对 anastasis 的观察, 这也显示了在磷脂外化22、23、24、有限的线粒体外部的恢复后的细胞膜性25, 混合谱系激酶样 (MLKL) 的激活, 和单元收缩26。
定性的机制调节 anastasis 将有范式转移的生理, 病理和治疗的影响。Anastasis 可能代表一个以前未知的细胞机制, 以抢救或保存重要的 postmitotic 细胞和组织难以取代, 并可能考虑心力衰竭逆转心室卸载左心室辅助设备 (LVADs)27,28, 在瞬态曝光过多光后恢复感光细胞29,3031, 或修复脑损伤后的神经元32。如果这样促进 anastasis 可以增强细胞和组织的恢复。相反, anastasis 可能是一个意想不到的逃生策略, 用于癌症细胞生存细胞死亡诱导治疗, 导致癌症复发17,18。因此, 在癌症治疗期间和之后抑制癌细胞的 anastasis 可能是一种新的治疗癌症的方法, 防止肿瘤复发。
在 anastasis 过程中, 我们发现一些恢复细胞获得永久性的基因改变, 并进行了致癌转化, 可能是由于在细胞凋亡期间发生的 DNA 损伤18,20,21.逆转 DNA 受损细胞的死亡过程可能是一种肿瘤发生的机制, 潜在的潜在的观察, 重复组织损伤增加了癌症的风险在各种组织, 如慢性热损伤的食道诱发由非常热的饮料的消耗量33,34,35, 由于酒精中毒的肝脏损伤36,37, 肿瘤演变在毒性癌症治疗以后38, 39,40, 以及在抗肿瘤治疗周期的间隔期间出现的正常组织的新癌症的发展41,4243,44.如果属实, 靶向 anastasis 可以预防或阻止癌症的发展和进展。我们发现, 饥饿诱导的垂死生殖细胞在再喂食的果蝇19中接受 anastasis。 如果 anastasis 发生在 DNA 损伤的生殖细胞中, 则可以解释长期环境压力促进遗传疾病的发展。例如, 饥荒有助于代遗传性疾病如糖尿病和冠心病的发展,45。因此, 了解 anastasis 可能导致预防这种潜在机制引起的遗传性疾病的战略。
利用 anastasis 的发现, 引导其发展创新的治疗方法, 研究 anastasis 在活体动物中的病因和后果是十分必要的。然而, 在技术上挑战识别和追踪 anastatic 细胞在体内, 因为从细胞死亡过程中恢复的细胞在形态上与正常的健康细胞没有区别, 并且没有生物标志物 anastasis已识别17,18,21。为了解决这些问题, 我们最近开发了一个新的体内酶生物传感器指定的 "CaspaseTracker"19, 以识别和跟踪细胞凋亡后, 酶激活19,46,凋亡的标志10,14。区别于 "实时" 酶生物传感器, 如散射12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51和 iCasper52检测正在进行的酶活动, CaspaseTracker 生物传感器另外还具有永久性标记酶活动的细胞的能力, 甚至是瞬时的。因此, CaspaseTracker 生物传感器可以在逆转酶介导的细胞死亡过程的 anastasis 后进行长期跟踪,在体内。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (希腊语为 "上升到生活") 是最近被发现的细胞补救现象, 藉以垂危的细胞能逆转被假设是固有地不可逆转的晚阶段细胞死亡过程。促进 anastasis 原则上可以挽救或保存难以取代的细胞, 如心肌细胞或神经元, 从而促进组织的恢复。相反, 抑制癌细胞中的 anastasis, 在抗肿瘤治疗后细胞凋亡, 可确保癌细胞死亡, 减少复发几率。然而, 由于缺乏追踪活动物 anastasis 细胞命运的工具, 这些研究受到了阻碍。面临的挑战是确定细胞死亡的过程, 尽管它们在恢复后的形态正常的外观。为了克服这一困难, 我们开发了果蝇和哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器系统, 可以识别和永久跟踪 anastatic 细胞的体外或体内。在这里, 我们提出的在体内协议的产生和使用的 CaspaseTracker 双生物传感器系统检测和跟踪 anastasis 在果蝇后短暂接触细胞死亡刺激。虽然传统的生物传感器和协议可以标记细胞积极进行凋亡细胞死亡, CaspaseTracker 传感器可以永久标签细胞已经恢复后, 酶活化-一个标志的晚期细胞凋亡, 并同时确定活动的凋亡过程。这种生物传感器还可以追踪那些直接或间接参与酶活动的其他细胞死亡的细胞的恢复。因此, 这项议定书使我们能够不断追踪这些细胞及其后代的命运, 促进未来的生物学功能、分子机制、生理和病理后果的研究, 以及治疗的意义anastasis我们还讨论了适当的控制, 以区分接受 anastasis 的细胞从那些显示非凋亡的酶活动在体内。

虽然时间推移活细胞显微镜是一种可靠的方法, 以道 anastasis 在培养细胞20, 它是挑战, 以确定哪些细胞已经经历了 anastasis 在动物, 因为恢复细胞出现形态上无法区分从没有尝试过细胞死亡的正常健康细胞。例如, 人宫颈癌 HeLa 细胞显示凋亡的形态学特征1,2,14, 如细胞萎缩, 核冷凝, 和细胞膜起泡, 以响应细胞死亡...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis 在技术上具有挑战性检测在体内, 因为逆转细胞死亡过程的细胞可以从形态上区分正常健康细胞。在这里, 我们描述了通过使用我们新近开发的体内CaspaseTracker 生物传感器系统来检测和跟踪在活体动物中 anastasis 的细胞的协议。

用 CaspaseTracker 生物传感器检测 Anastasis体内

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

在犬体内的肌肉功能测定

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

科研

医学

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

在体内的双基体生物光学成像

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis

研究方法检测疑似急性冠脉综合征患者短暂心肌缺血的连续ST段分析

Each year, an estimated 785,000 Americans will have a new coronary attack, or acute coronary syndrome (ACS). The pathophysiology of ACS involves rupture ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

在体内 19女性 MRI对细胞跟踪

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

按时间当然吲哚菁绿血管造影检测脉络膜血管系统异常在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

宫内遥测来衡量鼠标收缩压力<em&gt;在体内</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

玫瑰红Photothrombosis共聚焦光学成像<em&gt;在体内</em&gt;：单支脑卒中模型

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

触发反应胶质细胞增生<em&gt;在体内</em&gt;由前脑锐器伤

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Microtumors使用3D人体Biogel培养体系和病人源性胶质母细胞瘤的Kinomic剖析和药物反应测试的生成

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

从人类肿瘤异种移植的小鼠细胞的消耗显着改善靶细胞下游分析

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...