Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Vi takker Darren Obbard for Drosophila billedet i figur 3 c og video manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson og Heather M. Lamb for værdifuld diskussion af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright give 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation stipendium (H.L.T.), og NIC K22 give CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var en Mettes og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

1) forberedelse af CaspaseTracker Biosensor fluer
<ol><li>Bedøver fluer med CO2, og brug en pensel til at overføre 7 til 10 caspase-følsomme Gal4 (DQVD)19 jomfruelige hunner og 7 til 10 G-Trace53 Gal4 reporter unge mandlige fluer (eller omvendt) i den samme hætteglas med flyve mad og frisk gær pasta. Bemærk: Tværs af Caspase-følsomme (DQVD) Gal4 og G-Trace fluer vil producere CaspaseTracker afkom fluer. Krydse af Caspase -if...

CaspaseTracker dobbelt biosensor system er en roman og unikt værktøj, der tillader detektering af de seneste eller igangværende caspase aktivitet, og sporing af celler, der har vendt celledød og overleve efter at have oplevet caspase aktivitet i vivo. Mens caspase aktivitet er traditionelt blevet antaget som kendetegnende for apoptose, viser voksende undersøgelser, at ikke-apoptotiske caspase aktivitet spiller potentielle roller i forskellige normal cellefunktioner, såsom r...

Programmeret celledød, såsom apoptose, spiller en væsentlig rolle i embryonale udvikling og normal homøostase ved at fjerne uønskede, tilskadekomne eller farlige celler i flercellede organismer1,2,3. Tab af balance mellem celledød og overlevelse kan føre til fatale konsekvenser som kræft, hjertesvigt, autoimmunitet og degeneration4,5,6,7,8. Aktivering af bøddel caspases har traditionelt været betragtet som "point of no return" i apoptose9,10,11, som det udløser hurtig og massiv cellulære nedrivning12, 13,14,15,16. Udfordrende denne generelle dogme, viste vi at kulturperler døende primære celler og kræftceller kan genoprette ikke kun efter caspase aktivering, men også følgende vigtige celle død kendetegnende herunder plasma membran blebbing, celle svind, mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytokrom c i cytosol, nukleare og kromatin kondens, DNA-skader, nukleare fragmentering, celle overflade eksponering af Phosphatidylserin (PS), og dannelsen af apoptotiske organer 17 , 18 , 19 , 20 , 21. foreslår vi at anastasis er en iboende celle opsving fænomen, som døende celler kan genoprette efter fjernelse af celle død stimuli17,18,19,20, 21. Vi opfandt udtrykket "Anastasis" (Αναστάσης)18, hvilket betyder "stiger til livet" på græsk, at beskrive fænomenet uventede celle opsving. Vores observation af anastasis understøttes yderligere af de seneste uafhængige undersøgelser, der også afslører inddrivelse af celler efter phosphatidylserin udlægning22,23,24, begrænset mitokondrie ydre membran permeabilization25, aktivering af blandet lineage kinase-lignende (MLKL), og celle svind26.
Kendetegner de mekanismer, der regulerer anastasis vil have paradigme-shifting fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkninger. Anastasis kunne repræsentere en hidtil ukendt cytoprotective mekanisme til at redde eller bevare vigtige postmitotic celler og væv, der er vanskelig at erstatte, og eventuelt konto for hjertesvigt tilbageførsel af ventrikulær losning med venstre ventrikel hjælpe enheder (LVADs)27,28, inddrivelse af fotoreceptor celler efter forbigående eksponering af overdreven lys29,30,31, eller reparation af neuroner efter hjernen skade32. Hvis så fremme anastasis kunne øge celle og væv opsving. Omvendt kunne anastasis være en uventet undslippe taktik bruges af kræftceller til at overleve celle-død-inducerende terapi, forårsager kræft tilbagefald17,18. Derfor, undertrykke anastasis døende kræftceller under og efter kræftbehandling kan være en roman terapeutisk strategi at helbrede kræft ved at forhindre deres tilbagefald.
Under processen med anastasis, har vi fundet at nogle gendannede celler erhvervet permanent genetiske ændringer og undergik muterede transformation, sandsynligvis på grund af DNA-skader opstået under apoptose18,20,21 . Vende dødsprocessen af DNA-beskadigede celler kunne være en mekanisme af tumordannelse, potentielt underliggende den observation, at gentagne vævsskade øger risikoen for kræft i en række forskellige væv, såsom kronisk termisk skade i spiserøret induceret ved indtagelse af meget varme drikke33,34,35, leverskader på grund af alkoholisme36,37, tumor udvikling efter genotoksiske kræft terapi38, 39,40, og udvikling af nye kræfttilfælde fra normale væv, der opstår under intervallerne mellem cyklusser af anti-cancer terapi41,42,43,44 . Hvis sand, kunne målretning anastasis forhindre eller anholde kræft udvikling og progression. Vi har fundet, at sult-induceret døende kønsceller gennemgå anastasis i re fodret Drosophila19.  Hvis anastasis forekommer i kimceller med DNA-skader, kunne det være konto for den iagttagelse, at langvarig miljømæssige stress fremmer udviklingen af genetiske sygdomme. For eksempel, bidrage hungersnød til udviklingen af transgenerationel arvelige sygdomme som diabetes og koronar hjertesygdomme45. Derfor kunne forståelse anastasis føre til strategier til forebyggelse af udvikling af arvelige sygdomme forårsaget af denne potentielle mekanisme.
For at udnytte opdagelsen af anastasis og direkte til at udvikle innovative behandlinger, er det vigtigt at undersøge årsag og konsekvens af anastasis med levende dyr. Men det er en teknisk udfordring at identificere og spore anastatic celler i vivo, fordi de celler, der inddrives fra celle dødsprocessen vises morfologisk umulig at skelne fra normale raske celler, og der er ingen biomarkør for anastasis identificeret endnu17,18,21. For at løse disse problemer, vi for nylig udviklet en ny i vivo caspase biosensor udpeget "CaspaseTracker"19, til at identificere og spore celler, der overlever apoptose efter caspase aktivering19,46, den Hallmark af apoptose10,14. Adskiller det fra "real-time" caspase biosensorer såsom SCAT12,47, Apoliner48, CA-normal god landbrugspraksis49, ApoAlert18,50, C3AIs51 og iCasper52 der registrerer løbende caspase aktivitet, CaspaseTracker biosensor desuden egenskaber evne hen til permanent mærke cellerne at udtrykke caspase aktivitet selv forbigående. Derfor muliggør CaspaseTracker biosensor lang sigt sporing af anastasis efter tilbageførsel af caspase-medieret celle død proces in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (græsk for "stigende til liv") er en nylig opdaget celle opsving fænomen hvor døende celler kan tilbageføre sene celle død processer, som generelt antages for at være uløseligt irreversibel. Fremme anastasis kunne i princippet redning eller Bevar sårede celler, der er svære at erstatte såsom cardiomyocytes eller neuroner, dermed at lette væv opsving. Omvendt, undertrykke anastasis i kræftceller, undergår apoptose efter anti-kræft behandlinger, kan sikre kræft celledød og mindske risikoen for tilbagefald. Men disse undersøgelser har været hæmmet af manglen på værktøjer til at spore skæbnen af celler, der undergår anastasis med levende dyr. Udfordringen er at identificere de celler, der har vendt celle dødsprocessen trods deres morfologisk normale udseende efter helbredelse. For at overvinde denne vanskelighed, har vi udviklet Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensor systemer, der kan identificere og permanent spore anastatic celler in vitro eller i vivo. Vi præsenterer her, i vivo protokoller til produktion og brug af CaspaseTracker dual biosensor system til at registrere og spore anastasis i Drosophila melanogaster efter forbigående eksponering for celle død stimuli. Mens konventionelle biosensorer og protokoller kan mærke cellerne aktivt undergår apoptotisk celledød, CaspaseTracker biosensor permanent kan mærke celler, der har genvundet efter caspase aktivering - kendetegnende for sene apoptose, og samtidig identificere aktive apoptotiske processer. Denne biosensor kan også spore inddrivelse af de celler, der forsøgte andre former for celledød, der direkte eller indirekte involveret caspase aktivitet. Derfor, denne protokol giver os løbende spore disse celler og deres afkom, lette fremtidige studier af biologiske funktioner, molekylære mekanismer, fysiologiske og patologiske konsekvenser og terapeutiske virkninger af skæbne Anastasis. Vi diskuterer også de passende kontrol for at skelne mellem celler, der undergår anastasis fra dem, der viser ikke-apoptotiske caspase aktivitet in vivo.

Mens time-lapse levende celle mikroskopi er en pålidelig metode til tarmkanalen anastasis i kulturperler celler20, er det udfordrende at identificere, hvilke celler har undergået anastasis i dyr, fordi de gendannede celler vises morfologisk skelnes fra normale sunde celler, der ikke har forsøgt celledød. For eksempel, vises menneskelige livmoderhalskræft HeLa celler morfologiske kendetegnende for apoptose1,2,<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis teknisk udfordrende for at opdage i vivo , fordi de celler, der har vendt den celle død proces kan være morfologisk umulig at skelne fra normale sunde celler. Her beskriver vi protokoller til påvisning og spore celler, der undergår anastasis i levende dyr ved hjælp af vores nyudviklede i vivo CaspaseTracker biosensor system.

Påvisning af Anastasis In Vivo af CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis

Each year, an estimated 785,000 Americans will have a new coronary attack, or acute coronary syndrome (ACS). The pathophysiology of ACS involves rupture ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Afsløring Abnormiteter i Choroidal karrene i en musemodel af Aldersrelateret makuladegeneration af Time-kursus indocyaningrønt angiografi

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri måler Mouse kontraktile Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis ved Konfokal Optical Imaging<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Udløsning Reactive gliose<em&gt; In vivo</em&gt; Af en forhjerne Stab Skade

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation af Microtumors Brug 3D Menneskelig Biogel Kultur System og Patient-afledte glioblastomaceller for Kinomic Profilering and Drug respons Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...