Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Nous remercions Darren Obbard Drosophila image dans la Figure 3 et vidéo manuscrit ; J. Marie Hardwick, Wade Gibson et Heather M. Lamb pour une analyse précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) et NCI K22 accordent CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang était un h et Kay Curci Foundation Fellow de la Fondation de recherche de Sciences de la vie (2014-2017).

1) préparation du biocapteur CaspaseTracker mouches
<ol><li>Anesthésier les mouches avec du CO2et utiliser un pinceau pour transférer les femelles vierges de 7 à 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 et 7 à 10 G-Trace53 Gal4 journaliste jeunes mouches mâles (ou vice versa) dans le même flacon avec alimentation mouche et la pâte de levure fraîche. Remarque : Croix de mouches Gal4 Caspase-sensibles (DQVD) et G-Trace produira des mouches...

Le système de double biocapteur CaspaseTracker est un outil unique qui permet de détecter ces dernières et novateur ou activité de la caspase en cours et le suivi des cellules qui ont renversé la mort cellulaire traitent et survivent après avoir connu caspase activité in vivo. Alors que l’activité de la caspase a été traditionnellement considérée comme une caractéristique de l’apoptose, croissant des études révèlent que non-apoptotic caspase activité joue un ...

Mort programmée de cellules, telles que l’apoptose, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie normale en éliminant les cellules indésirables, blessés ou dangereux dans les organismes multicellulaires1,2,3. La perte de l’équilibre entre la mort cellulaire et la survie peut conduire à des conséquences mortelles comme le cancer, insuffisance cardiaque, auto-immunité et dégénérescence4,5,6,7,8. L’activation de bourreau caspases a traditionnellement été considérée comme le « point de non retour » dans l’apoptose9,10,11, telle qu’elle déclenche rapide et massive de destruction cellulaire12, 13,14,15,16. Contestant ce dogme général, nous avons démontré que les cellules primaires mourants cultivées et des cellules cancéreuses peuvent récupérer non seulement après l’activation de la caspase, mais aussi suivant cellule important poinçons de mort dont la membrane plasmique blebbing, rétrécissement de la cellule, fragmentation mitochondriale, libération de mitochondrial du cytochrome c dans le cytosol, nucléaire et condensation de la chromatine, dommages à l’ADN, fragmentation nucléaire, exposition de surface cellulaire de la phosphatidylsérine (PS) et la formation de corps apoptotiques 17 , 18 , 19 , 20 , 21. nous proposons cette anastasis est un phénomène de récupération cellule intrinsèques, comme les cellules mourantes peuvent récupérer après le retrait de cellule mort des stimuli17,18,19,20, 21. on a inventé le terme « Anastasis » (Αναστάσης)18, qui signifie « s’élevant à vie » en grec, à décrire ce phénomène de récupération cellule inattendu. Notre observation d’anastasis est confirmée par récentes études indépendantes qui révèlent également la récupération des cellules après phosphatidylsérine externalisation22,23,24, limitée mitochondriale externe membrane perméabilisation25, activation de lignée mixte comme kinase (MLKL) et cellule rétrécissement26.
Caractériser les mécanismes régulant l’anastasis aura des implications de physiologiques, pathologiques, thérapeutiques ou de paradigme. Anastasis pourrait représenter un mécanisme de cytoprotecteurs jusque-là inconnues sauver ou préserver les cellules postmitotiques importantes et les tissus qui sont difficiles à remplacer et éventuellement compte d’inversion de l’insuffisance cardiaque par décharge ventriculaire avec ventriculaire gauche aider les dispositifs (LVAD)27,28, récupération des cellules photoréceptrices après exposition transitoire de lumière excessive29,30,31, ou la réparation des neurones après lésion de cerveau32. Si donc promouvoir anastasis pourrait améliorer la récupération de cellules et de tissus. À l’inverse, l’anastasis pourrait être une tactique inattendue d’échappement utilisée par les cellules cancéreuses de survivre à la thérapie cellulaire-induisant la mort, causant le cancer récidive17,18. Par conséquent, supprimant anastasis en mourant de cellules cancéreuses pendant et après que le traitement du cancer pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir le cancer en empêchant leur rechute.
Au cours du processus de l’anastasis, nous avons trouvé que certaines cellules récupérées acquis des altérations génétiques permanentes et a subi une transformation oncogénique, probablement en raison de dommages à l’ADN engagées au cours de l’apoptose18,20,21 . Inverser le processus de mort des cellules endommagées de l’ADN pourrait être un mécanisme de la tumorigenèse, potentiellement qui sous-tend l’observation qui répète la lésion tissulaire augmente le risque de cancer dans une variété de tissus, comme une lésion thermique chronique dans l’oesophage provoquée par par la consommation de boissons très chaudes33,34,35, atteinte hépatique due à l’alcoolisme36,37, évolution de la tumeur après génotoxique du cancer therapy38, 39,40et le développement de nouveaux cancers des tissus normaux qui surviennent pendant les intervalles entre les cycles de traitement anticancéreux41,42,43,44 . Si true, ciblant l’anastasis pourrait prévenir ou arrêter le développement du cancer et la progression. Nous avons trouvé que la famine induite par les cellules germinales mourants subissent anastasis réalimenté Drosophila19.  Si anastasis se produit dans les cellules germinales avec altération de l’ADN, ça pourrait être responsables de l’observation qui prolonge le stress environnemental favorise le développement des maladies génétiques. Par exemple, famines contribuent à l’apparition de maladies héréditaires transgénérationnel comme le diabète et les maladies coronariennes,45. Par conséquent, compréhension anastasis pourrait conduire à des stratégies de prévention des maladies héréditaires causée par ce mécanisme potentiel.
Pour exploiter la découverte de l’anastasis et dirigez-la à développer des thérapies innovantes, il est essentiel d’étudier la cause et la conséquence de l’anastasis animaux vivants. Toutefois, il est techniquement difficile de repérer les cellules anastatique in vivo, car les cellules qui recouvré des processus de mort cellulaire apparaissent morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales, et il n’y a aucun marqueur biologique de l’anastasis identifiés encore17,18,21. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment mis au point un nouveau en vivo caspase biocapteur désigné « CaspaseTracker »19, pour repérer les cellules qui survivent l’apoptose après activation de caspases19,46, le caractéristique de l’apoptose10,14. Il distingue les biocapteurs « temps réel » caspase tels que SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 et iCasper52 détectant l’activité en cours de caspase, le biocapteur CaspaseTracker dispose en plus de la possibilité d’étiqueter en permanence des cellules cette activité de caspase express même éphémère. Le biocapteur CaspaseTracker permet donc, suivi à long terme de l’anastasis après le renversement de caspase-mediated cell death processus in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (« ressusciter à la vie » en grec) est un phénomène de récupération cellulaire récemment découverte par lequel mourir cellules peut inverser les processus de mort cellulaire avancé qui sont généralement considérées comme intrinsèquement irréversibles. Promotion anastasis pourraient blesser dans le sauvetage de principe ou de conserver des cellules qui sont difficiles à remplacer comme cardiomyocytes ou neurones, facilitant ainsi la récupération de tissu. À l’inverse, supprimant l’anastasis dans les cellules cancéreuses, en apoptose après traitements anticancéreux, peut assurer la mort des cellules cancéreuses et réduire les risques de récidive. Toutefois, ces études ont été entravés par le manque d’outils pour suivre le destin des cellules subissant anastasis animaux vivants. Le défi consiste à identifier les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire malgré leur apparence morphologiquement normaux après récupération. Pour surmonter cette difficulté, nous avons développé la drosophile et les systèmes mammaliens biocapteur CaspaseTracker qui peuvent d’identifier et de suivre en permanence l’anastatique cellules in vitro ou in vivo. Nous présentons ici en vivo de protocoles pour la génération et l’utilisation du système dual biocapteur CaspaseTracker pour détecter et pister anastasis chez Drosophila melanogaster après exposition transitoire à des stimuli de mort cellulaire. Tandis que les biocapteurs classiques et protocoles peuvent marquer des cellules mort cellulaire par apoptose activement en cours, le biocapteur CaspaseTracker peut marquer définitivement les cellules qui ont récupéré après activation de la caspase - une caractéristique de l’apoptose des stades, et en même temps identifier les processus apoptotique active. Ce biocapteur permet également de suivre la récupération des cellules qui ont tenté d’autres formes de mort cellulaire qui impliqués directement ou indirectement l’activité caspase. Par conséquent, ce protocole permet de suivre en permanence le sort de ces cellules et leur progéniture, facilitant les études futures des fonctions biologiques, les mécanismes moléculaires, les conséquences physiologiques et pathologiques et implications thérapeutiques de Anastasis. Nous discutons également les contrôles appropriés pour distinguer les cellules subissant anastasis de ceux qui affichent non-apoptotic caspase activité in vivo.

Microscopie des cellules vivantes Time-lapse est une méthode fiable pour tract anastasis dans des cellules cultivées20, mais il est difficile d’identifier les cellules qui ont subi l’anastasis chez les animaux, parce que les cellules récupérés apparaissent morphologiquement indiscernables des cellules saines normales qui n’ont pas tenté de mort cellulaire. Par exemple, les cellules humaines de cancer du col utérin HeLa affichent des caractéristiques morphologiques de l’apoptose<sup...

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

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