Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

אנו מודים דארן Obbard על תמונה דרוזופילה 3C איור כתב היד וידאו; ג'יי מארי הארדוויק, ווייד גיבסון ו הת'ר כבש מסיה לדיון בעל ערך של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי סר אדוארד יואו-דה אנדרטת מלגת (H.L.T.), ד ר וולטר Szeto ממוריאל מלגה (H.L.T.), מלגת פולברייט 007-2009 (H.L.T.), מלגת קרן מחקר מדעי החיים (H.L.T.), NCI K22 הענק CA204458 (H.L.T.). Ho Tang לאם היה Shurl קיי קורצ'י קרן עמית של קרן מחקר מדעי החיים (2014-2017).

1) הכנת CaspaseTracker ביוסנסור זבובים
<ol><li>עזים ומתנגד זבובים עם CO2ולאחר להשתמש במכחול כדי להעביר 7 עד 10 קספאז רגיש Gal4 (DQVD)19 בתולה נקבות ו- 7 10 G-מעקב53 Gal4 כתב צעיר זבובים זכרים (או להיפך) בבקבוקון אותו עם אוכל לטוס והדבק שמרים טריים. הערה: הצלב של הזבובים קספ?...

מערכת כפולה ביוסנסור CaspaseTracker הוא הרומן ו כלי ייחודי המאפשר איתור של האחרונים או פעילות קספאז שוטף ומעקב של תאים כי ביצעו היפוך מוות תאי לעבד ולשרוד לאחר שנוכחו קספאז פעילות ויוו. בזמן פעילות קספאז הייתה ההנחה באופן מסורתי כמו סימן היכר של אפופטוזיס, הולך וגדל ומחקרי...

מות תאים מתוכנת, כגון אפופטוזיס, ממלא תפקיד חיוני בתחום הפיתוח עובריים הומאוסטזיס נורמלי על ידי ביטול תאים לא רצויים, פצוע או מסוכנים אורגניזמים רב תאיים1,2,3. האובדן של איזון בין מוות תאי ההישרדות יכול להוביל לתוצאות קטלניות כגון סרטן, אי ספיקת לב, מחלת חיסון עצמי, ניוון4,5,6,7,8. הפעלה של התליין caspases באופן מסורתי נחשב כמו "נקודת האל חזור" אפופטוזיס9,10,11, כפי שהוא מפעיל מהירה ומסיביים הריסה הסלולר12, 13,14,15,16. מאתגר את הדוגמה כללית, הפגנו כי תאים בתרבית ראשי הגוסס ותאים סרטניים יכול לשחזר לא רק לאחר הפעלת קספאז, אבל גם הבאים תא חשוב המחפשים מוות כולל קרום פלזמה blebbing, הצטמקות תא, פיצול מיטוכונדריאלי, שחרורו של מיטוכונדריאלי ציטוכרום c לתוך ציטוזול, גרעיני, עיבוי כרומטין, נזק לדנ א, פיצול גרעינית, חשיפת פני שטח התא phosphatidylserine (PS), ועל היווצרות אפופטוטיים להיפגע גופות 17 , 18 , 19 , 20 , 21. אנו מציעים anastasis הזה הוא תופעה שחזור תאים פנימיים, כמו תאים גוסס יכול לשחזר לאחר הסרת תאים מוות גירויים17,18,19,20, 21. אנחנו טבע את המונח "Anastasis" (Αναστάσης)18, מה שאומר "עולה לחיים" ביוונית, כדי לתאר את התופעה שחזור התא לא צפוי. שלנו התבוננות anastasis נוספות נתמך על ידי מחקרים עצמאיים החושפים גם שחזור של תאים לאחר phosphatidylserine הוצאתו22,23,24, מוגבל מיטוכונדריאלי החיצוני קרום permeabilization25, הפעלה של השושלת מעורב קינאז כמו (MLKL) ותא הצטמקות26.
אפיון מנגנוני ויסות anastasis יהיו השלכות פיזיולוגיות פתולוגי, טיפולית הפרדיגמה-shifting. Anastasis יכול לייצג מנגנון cytoprotective לא מוכרת או לשמר תאים postmitotic חשוב, רקמות שקשה להחליף, ואולי חשבון עבור היפוך אי ספיקת לב על ידי חדרית פריקה עם השמאל חדרית לסייע27,התקנים (LVADs)28, שחזור של תאים קולט אור לאחר חשיפה ארעית של אור מופרז29,30,31, או תיקון של נוירונים לאחר פגיעה במוח32. אם כך קידום anastasis יכול לשפר את שחזור תאים ורקמות. לעומת זאת, anastasis יכול להיות טקטיקת בריחה בלתי צפוי בשימוש על ידי תאים סרטניים לשרוד טיפול גרימת מוות התא, גורם לסרטן הישנות17,18. לכן, דיכוי anastasis בלמות תאים סרטניים במהלך ואחרי הטיפול בסרטן יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשנית כדי לרפא סרטן על ידי מניעת התדרדרות שלהם.
במהלך התהליך של anastasis, מצאנו כי כמה תאים התאושש רכשה שינויים גנטיים קבועים, עברה שינוי oncogenic, ככל הנראה בגלל נזק לדנ א שנצברו במהלך אפופטוזיס18,20,21 . היפוך תהליך מוות של תאים פגומים-דנ א יכול להיות מנגנון של tumorigenesis, פוטנציאל שבבסיס את התצפית כי חזר על פגיעה ברקמות מגביר את הסיכון של סרטן במגוון של רקמות, כגון פגיעה תרמי כרונית בוושט הנגרמת על ידי הצריכה של משקאות חמים מאוד33,34,35, נזק לכבד עקב אלכוהוליזם36,37, התפתחות הגידול לאחר טיפול בסרטן genotoxic38, 39,40, ויש התפתחות סרטן חדשים מרקמות נורמלי המתעוררות במהלך המרווחים בין מחזורי טיפול נגד סרטן41,42,43,44 . אם true, מיקוד anastasis יכול למנוע או לעצור התפתחות סרטן והתקדמות. מצאנו רעב-induced בתאי הנבט הגוסס עוברים anastasis דרוזופילהמחדש הפדרציה19.  אם anastasis מתרחשת בתאי הנבט עם נזק לדנ א, זה יכול להיות חשבון עבור התצפית כי ממושך עקה מקדם התפתחות של מחלות גנטיות. לדוגמה, הרעב תורמים להתפתחות של transgenerational למחלות כמו סוכרת, מחלות לב כליליות45. לכן, הבנה anastasis עלול להוביל אסטרטגיות למניעת פיתוח שעברו בירושה מחלות שנגרמות על ידי מנגנון פוטנציאל זה.
כדי לרתום את הגילוי של anastasis וישיר אותו לפתח טיפולים חדשניים, זה חיוני כדי ללמוד על סיבה ותוצאה של anastasis בבעלי חיים. עם זאת, זה טכנית מאתגר לזהות ולעקוב anastatic תאים ויוו, כי התאים התאוששה תהליך מוות תאי מופיעים מורפולוגית להבחין מגניחותיה תאים בריאים נורמלי, ויש אין סמן של anastasis מזוהה אך17,18,21. כדי לטפל בבעיות אלו, שפיתחנו לאחרונה חדש ויוו קספאז ביוסנסור המיועד "CaspaseTracker"19, לזהות ולעקוב תאים ששורדים אפופטוזיס לאחר הפעלת קספאז19,46, סימן ההיכר של אפופטוזיס10,14. המבדיל אותו קספאז "בזמן אמת" ביולוגיים כגון לצואת12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 , iCasper52 זה מגלה פעילות קספאז מתמשך, החיישן CaspaseTracker כולל בנוסף את היכולת לצמיתות תווית תאים הפעילות קספאז אקספרס אפילו transiently. לכן, החיישן CaspaseTracker מאפשר מעקב ארוך טווח של anastasis לאחר היפוך של קספאז בתיווך תא תהליך המוות בתוך vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

אנסתזיס (מיוונית "מתגברת לחיים"): היא תופעה שחזור תא שנתגלתה לאחרונה לפיה למות תאים יכול להפוך תהליכים מוות תאים בשלב מאוחר מטופלות בדרך כלל להיות מהותי בלתי הפיכות. קידום anastasis יכול עיקרון הצלה או לשמר נפגע תאים שנמצאים קשה להחליף כגון cardiomyocytes או נוירונים, ובכך להקל שחזור רקמות. לעומת זאת, דיכוי anastasis של תאים סרטניים, שעברו אפופטוזה לאחר טיפולים אנטי סרטניים, עשויה להבטיח מוות תאי סרטן ולהפחית את הסיכוי להישנות. עם זאת, מחקרים אלה יש כבר הקשו על ידי חוסר של כלי למעקב אחר גורלם של תאים עוברים anastasis בבעלי חיים. האתגר הוא לזהות את התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים למרות הופעתם מורפולוגית נורמלי לאחר השחזור. כדי להתגבר על הקושי הזה, פיתחנו דרוזופילה ו בתרבית של מערכות ביוסנסור CaspaseTracker זה יכול לזהות ולעקוב באופן קבוע את התאים anastatic חוץ גופית בתוך או ויוו. כאן, אנו מציגים ויוו פרוטוקולים עבור הדור והשתמש של מערכת ביוסנסור כפול CaspaseTracker לזהות ולעקוב אחר anastasis ב דרוזופילה melanogaster לאחר ארעי חשיפה לגירויים מוות התא. בעוד ביולוגיים קונבנציונאלי ופרוטוקולים יכול תווית תאים מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע באופן פעיל העובר, החיישן CaspaseTracker יכול לצמיתות תווית תאים התאוששו לאחר קספאז ההפעלה - סימן היכר של אפופטוזיס בשלב מאוחר, ו במקביל לזהות תהליכים אפופטוטיים להיפגע פעיל. ביוסנסור הזה יכול גם לעקוב אחר התאוששות התאים ניסיון צורות אחרות של מוות של תאים במישרין או בעקיפין מעורבים קספאז פעילות. לכן, פרוטוקול זה מאפשר לנו לעקוב באופן רציף את גורלו של תאים אלה, הצאצאים שלהם, בקידום מחקרים עתידיים של תפקודים ביולוגיים, המנגנונים המולקולריים, השלכות פיזיולוגיים ופתולוגיים, השלכות טיפוליות anastasis. נדון גם הפקדים המתאימים כדי להבחין בין התאים עוברים anastasis מאלו המציגים שאינם אפופטוטיים להיפגע קספאז פעילות בתוך vivo.

בעוד תא חי זמן לשגות מיקרוסקופ הוא שיטה אמינה כדי בדרכי anastasis תאים בתרבית20, זה מאתגר כדי לזהות אילו תאים שעברו anastasis ב בעלי חיים, כי התאים התאושש מופיעים מורפולוגית להבחין מגניחותיה בין תאים בריאים נורמלי זה לא ניסו מוות של תאים. לדוגמה, תאים סרטניים בצוואר הרחם אנושיים הלה להצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis

שיטת מחקר לאיתור איסכמיה מיוקרדיאלית חלוף בחולים עם תסמונת כלילית חריפה חשד לשימוש בניתוח רציף ST-קטע

Each year, an estimated 785,000 Americans will have a new coronary attack, or acute coronary syndrome (ACS). The pathophysiology of ACS involves rupture ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

איתור ליקויים בChoroidal כלי דם במודל של עכברים של ניוון מקולרי הקשור בגיל בזמן הקורס Indocyanine הירוק אנגיוגרפיה

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

מפעילה תגובתי דבקה<em&gt; In vivo</em&gt; על ידי המוח הקדמי דקירת פגיעה

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...