Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Vi takker Darren Obbard for Drosophila bilde i figur 3 c og video manuskriptet; J. Marie Hardwick, Wade Gibson og Heather M. Lamb verdifull informasjon om dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Sir Edward Youde Memorial fellesskap (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial stipend (H.L.T.), Fulbright gi 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellesskap (H.L.T.) og NCI K22 gi CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

1) utarbeidelse av CaspaseTracker Biosensor fluer
<ol><li>Bedøve fluer med CO2, og bruk en pensel til å overføre 7 til 10 caspase-sensitive Gal4 (DQVD)19 jomfru kvinner og 7 til 10 G-spor53 Gal4 reporter unge mannlige fluer (eller omvendt) i samme ampullen med fly mat og fersk gjær pasta. Merk: Cross Caspase-sensitive (DQVD) Gal4 og G-spor fluer vil produsere CaspaseTracker avkom fluer. Cross Caspase -isensitive (DQVA)<sup class...

CaspaseTracker dobbelt biosensor system er en roman og unikt verktøy som tillater påvisning av nylig eller pågående caspase aktivitet og sporing av celler som tilbakeført celledød behandle og overleve etter caspase aktivitet i vivo. Mens caspase aktivitet har tradisjonelt antatt som et kjennetegn på apoptose, avslører voksende studier at ikke-apoptotisk caspase aktivitet spiller potensielle roller i ulike normal celle-funksjoner, for eksempel regulering av neuronal aktivi...

Programmert celledød som apoptose, spiller en viktig rolle i embryonale utviklingen og normal homeostase ved å fjerne uønsket, skadet eller farlig celler i multicellular organismer1,2,3. Tap av balansen mellom celledød og overlevelse kan føre til fatale konsekvenser som kreft, hjertesvikt, autoimmunitet og degenerasjon,4,,5,,6,,7,,8. Aktivering av bøddelen caspases har tradisjonelt vært ansett som den "point of no return" i apoptose9,10,11, som utløser rask og massive mobilnettet riving12, 13,14,15,16. Utfordrende denne generelle dogme, viste vi at kan kultivert døende primære celler og kreftceller gjenopprette ikke bare etter caspase aktivisering, men også følgende viktige celle død kjennetegnene inkludert plasma membran blebbing, celle krymping, Mitokondrielt fragmentering, utgivelsen av mitokondrie cytochrome c i stoffer kjernefysiske og chromatin kondens, DNA skade, kjernefysiske fragmentering, celle overflaten eksponering av fosfatidylserin (PS), og dannelsen av apoptotisk organer 17 , 18 , 19 , 20 , 21. foreslår vi at anastasis er en iboende celle utvinning fenomen, som døende celler kan gjenopprette etter fjerning av celle død stimuli17,18,19,20, 21. vi innførte begrepet "Anastasis" (Αναστάσης)18, som betyr "rising liv" på gresk, å beskrive denne uventede celle utvinning fenomen. Våre observasjon av anastasis støttes av uavhengige studier som også avslører utvinning av cellene etter fosfatidylserin eksternalisering22,23,24, begrenset mitokondrie ytre membran permeabilization25, aktivering av blandet herkomst kinase-lignende (MLKL) og celle krymping26.
Karakterisere mekanismer regulere anastasis vil ha paradigme-skifter fysiologiske, patologiske og terapeutiske konsekvenser. Anastasis kan representere en tidligere ukjent cytoprotective mekanisme for å redde eller bevare viktige postmitotic celler og vev som er vanskelig å erstatte, og muligens konto for hjertesvikt tilbakeføring av ventrikkel lossing med venstre ventrikkel hjelpe enheter (LVADs)27,28, utvinning av photoreceptor celler etter forbigående eksponering av overdreven lys29,30,31eller reparasjon av neurons etter hjernen skade32. Hvis så fremme anastasis kan forbedre celler og vev utvinning. Derimot kan anastasis være en uventet escape taktikk brukt av kreftceller for å overleve celle-død-inducing terapi, forårsaker kreft tilbakefall17,18. Derfor undertrykke anastasis dør kreftcellene under og etter behandling kan være en ny terapeutiske strategi å kurere kreft ved å hindre deres tilbakefall.
Under prosessen med anastasis, har vi funnet at noen gjenopprettede celler ervervet permanent genetiske endringer og gjennomgikk kreftfremkallende transformasjon, sannsynligvis på grunn av DNA skade påløper under apoptose18,20,21 . Reversere prosessen død av DNA-skadet celler kan være en mekanisme tumorigenesis, potensielt underliggende observasjon som gjentas tissue skade øker risikoen for kreft i ulike vev, slik som kronisk termisk skade i spiserøret indusert av inntak av svært varme drikker33,34,35, leverskader på grunn av alkoholisme36,37, svulst utviklingen etter gentoksisk kreft terapi38, 39,40, og utvikling av nye kreft fra normalt vev som oppstår under intervallene mellom sykluser av anti-kreft terapi41,42,43,44 . Hvis sann, kan målretting anastasis hindre eller arrestere hudkreft og progresjon. Vi har funnet at sult-indusert døende bakterie celler gjennomgå anastasis i nytt matet Drosophila19.  Hvis anastasis oppstår i bakterie celler med DNA skade, kan det konto for observasjon som langvarig miljøstress fremmer utviklingen av genetiske sykdommer. For eksempel bidra hungersnød til utviklingen av transgenerational arvelige sykdommer som diabetes og coronary hjertesykdommer45. Forståelse anastasis kan derfor føre til strategier for forebygging av utvikling arvelige sykdommer forårsaket av denne potensielle mekanismen.
Å utnytte oppdagelsen av anastasis og direkte å utvikle nyskapende terapier, er det viktig å studere årsaken og konsekvens av anastasis i levende dyr. Men er det teknisk utfordrende å identifisere og spore anastatic celler i vivo, fordi cellene som utvinnes fra celle død prosessen vises morphologically utvisket fra vanlige friske celler, og det er ingen biomarkør av anastasis identifisert ennå17,18,21. For å løse disse problemene, vi nylig utviklet en ny i vivo caspase biosensor utpekt "CaspaseTracker"19, til å identifisere og spore celler som overlever apoptose etter caspase aktivisering19,46, den Hallmark apoptose10,14. Skille det fra "real-time" caspase biosensors som SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 og iCasper52 som gjenkjenner pågående caspase aktivitet, den CaspaseTracker biosensor har i tillegg muligheten til permanent merke celler som uttrykker caspase aktivitet selv transiently. Derfor kan CaspaseTracker biosensor lang sikt sporing av anastasis etter reversering av caspase-mediert celle død prosessen i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (gresk for «rising liv») er et nylig oppdaget celle utvinning fenomen der døende celler kan reversere sent celle død prosesser som er vanligvis antatt for å være egentlig irreversible. Fremme anastasis kan i prinsippet redning eller bevare skadet celler som er vanskelig å erstatte som cardiomyocytes eller neurons, og dermed lette vev. Omvendt, undertrykker anastasis i kreftcellene, gjennomgår apoptose etter anti-kreft behandlinger, kan sikre celledød og redusere sjansene for regelmessighet. Men har disse studiene vært hemmet av mangel på verktøy for å spore skjebnen til celler som gjennomgår anastasis i levende dyr. Utfordringen er å identifisere celler som tilbakeført celle død prosessen til tross for deres morphologically normalt utseende etter utvinning. For å overkomme dette problemet, har vi utviklet Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensor systemer som kan identifisere og permanent spore anastatic celler i vitro eller i vivo. Her presenterer vi i vivo protokoller for generasjon og bruk av CaspaseTracker dobbelt biosensor system for å registrere og spore anastasis i Drosophila melanogaster etter forbigående eksponering for celle død stimuli. Mens konvensjonelle biosensors og protokoller kan merke celler aktivt i apoptotisk celledød, CaspaseTracker biosensor kan permanent merke celler som har kommet til hektene etter caspase aktivisering - et kjennetegn på sent apoptose, og samtidig identifisere aktive apoptotisk prosesser. Denne biosensor kan også spore utvinning av cellene som forsøkte andre former for celledød som direkte eller indirekte involvert caspase aktivitet. Derfor kan denne protokollen vi kontinuerlig spore skjebnen til disse cellene og deres avkom, tilrettelegge fremtidige studier av biologiske funksjoner, molekylære mekanismer, fysiologiske og patologiske konsekvenser og terapeutiske virkningene av anastasis. Vi diskuterer også riktige kontroller for å skille celler som gjennomgår anastasis fra de som viser ikke-apoptotisk caspase aktivitet i vivo.

Mens time-lapse levende celle mikroskopi er en pålitelig metode for skrift anastasis i kulturperler celler20, er det vanskelig å identifisere hvilke celler har gjennomgått anastasis i dyr, fordi de gjenopprettede cellene vises morphologically utvisket fra vanlige friske celler som ikke har forsøkt celledød. For eksempel vise menneskelige livmorhalskreft HeLa celler morfologiske kjennetegn av apoptose1,2,14...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis er teknisk utfordrende for å oppdage i vivo fordi cellene som tilbakeført celle død prosessen kan være morphologically utvisket fra vanlige friske celler. Her beskriver vi protokoller for å oppdage og spore celler som gjennomgår anastasis i levende dyr ved hjelp av nyutviklet i vivo CaspaseTracker biosensor systemet.

Oppdage Anastasis i Vivo av CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis

Each year, an estimated 785,000 Americans will have a new coronary attack, or acute coronary syndrome (ACS). The pathophysiology of ACS involves rupture ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Oppdager unormalt i Koroidal vasculature i en mus modell av Aldersrelatert macula degenerasjon av Time-retters indocyanine Grønn Angiografi

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri å måle Mouse kontraktile Trykk<em&gt; I Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal Optical Imaging<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av enkelt Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Utløsende Reaktiv gliose<em&gt; I Vivo</em&gt; Av en forhjerne Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generering av Microtumors Bruke 3D Menneskelig Biogel Kultur System og pasient-avledet glioblastom celler for Kinomic Profilering and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...