Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
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Agradecemos a Darren Obbard Drosophila imagen en Figura 3 y en manuscrito video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson y Heather M. Lamb para la valiosa discusión de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright concede 007-2009 (H.L.T.), beca de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (H.L.T.) y NCI K22 otorga CA204458 (H.L.T.). Ho Tang Lam era un Shurl y Kay Curci Foundation Fellow de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (2014-2017).

1) preparación del CaspaseTracker Biosensor vuela
<ol><li>Anestesiar a moscas con CO2y utilizar un pincel para transferir hembras vírgenes de 7 a 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 y 7 a 10 G-Trace53 Gal4 reportero joven macho vuela (o viceversa) en la misma cubeta con mosca comida y pasta de levadura fresca. Nota: Cruz de moscas Gal4 caspasa-sensible (DQVD) y G-Trace produce moscas de progenie de CaspaseTracker. Cruz de caspasa -en</e...

El sistema de doble biosensor CaspaseTracker es una novedosa y exclusiva herramienta que permite la detección de los últimos o actividad caspasa continua y seguimiento de las células que se han invertido muerte celular procesan y sobrevivieron después de experimentar actividad caspasa en vivo. Mientras que la actividad de caspasas ha asumido tradicionalmente como una característica distintiva de la apoptosis, cada vez más estudios revelan que no apoptótica caspasa activida...

Programan la muerte celular, como la apoptosis, juega un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis normal al eliminar no deseadas, heridas o peligrosas células en organismos multicelulares1,2,3. La pérdida del equilibrio entre la muerte celular y la supervivencia puede conducir a consecuencias fatales como cáncer, insuficiencia cardíaca, autoinmunidad y degeneración4,5,6,7,8. Desencadena la activación de caspasas ha sido considerada tradicionalmente como el "punto de no retorno" en apoptosis9,10,11, que verdugo demolición celular rápida y masiva12, 13,14,15,16. Desafiando este dogma general, hemos demostrado que cultivos de células primarias muertos y las células cancerosas pueden recuperar no sólo después de la activación de caspasas, pero importante también siguientes de la célula características distintivas de la muerte como membrana del plasma blebbing, contracción de la célula, la fragmentación mitocondrial, liberación mitocondrial del citocromo c al citosol, nuclear y condensación de la cromatina, daños en el ADN, fragmentación nuclear, la célula superficial exposición de fosfatidilserina (PS) y la formación de cuerpos apoptóticos 17 , 18 , 19 , 20 , 21. proponemos que anastasis es un fenómeno de recuperación de células intrínsecas, como la muerte de las células pueden recuperar después de la eliminación de la célula muerte estímulos17,18,19,20, 21. acuñó el término "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "levantamiento a la vida" en griego, para describir este fenómeno de recuperación inesperada de la célula. Nuestra observación de anastasis es apoyado por estudios independientes recientes que revelan también la recuperación de las células después de fosfatidilserina externalización22,23,24, limitado mitocondrial externa permeabilización de membrana25, activación de linaje mixto como quinasa (MLKL) y de contracción celular26.
Caracterización de los mecanismos de regulación de la anastasis tendrá consecuencias fisiológicas, patológicas y terapéuticas cambian paradigmas. Anastasis podría representar un mecanismo previamente desconocido citoprotector para rescatar o preservar importantes postmitotic células y tejidos que son difíciles de reemplazar y posiblemente cuenta de reversión de la insuficiencia cardíaca, ventricular descarga con ventrículo izquierdo ayudar a los dispositivos (VAD)27,28, recuperación de células fotorreceptoras después de la exposición transitoria de excesiva luz29,30,31, o reparación de las neuronas después de lesión de cerebro32. Si es así, promover la anastasis podría mejorar la recuperación de células y tejidos. Por el contrario, anastasis podría ser una táctica de escape inesperado utilizada por las células cancerosas a sobrevivir la terapia de inducción de muerte celular, causando cáncer recurrencia17,18. Por lo tanto, supresión de la anastasis al morir las células de cáncer durante y después de tratamiento contra el cáncer podría ser una nueva estrategia terapéutica para curar el cáncer mediante la prevención de sus recaídas.
Durante el proceso de anastasis, hemos encontrado que algunas células recuperadas adquirieron permanentes alteraciones genéticas y experimentaron la transformación oncogénica, probablemente debido a daños en el ADN que se incurra durante apoptosis18,20,21 . Invertir el proceso de muerte de las células dañadas de ADN podría ser un mecanismo de tumorigénesis, potencialmente subyacente a la observación que se repite la lesión tisular aumenta el riesgo de cáncer en una variedad de tejidos, tales como crónicas lesiones térmicas en el esófago inducida por por el consumo de bebidas muy calientes33,34,35, daño hepático por alcoholismo36,37, evolución del tumor después de genotóxicos cáncer terapia38, 39,40y el desarrollo de nuevos cánceres de los tejidos normales que surgen durante los intervalos entre los ciclos de terapia contra el cáncer41,42,43,44 . Si es true, dirigidos a anastasis podrían prevenir o detener el desarrollo del cáncer y la progresión. Hemos encontrado que inducido por hambre morir células de germen se someten a anastasis en re-fed Drosophila19.  Si anastasis se produce en las células germinales con daño en el ADN, puede ser cuenta para la observación de que prolongado estrés ambiental promueve el desarrollo de enfermedades genéticas. Por ejemplo, las hambrunas contribuyen al desarrollo de enfermedades heredables transgeneracionales como la diabetes y enfermedades coronarias del corazón45. Por lo tanto, comprensión anastasis podría conducir a estrategias para la prevención de enfermedades hereditarias causadas por este mecanismo potencial de desarrollo.
Para aprovechar el descubrimiento de anastasis y dirigirla para desarrollar terapias innovadoras, es esencial para el estudio de la causa y la consecuencia de la anastasis en animales vivos. Sin embargo, es técnicamente difícil para identificar y rastrear anastática células en vivo, porque las células que recuperados del proceso de muerte celular aparecen morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales, y no es ningún biomarcador de anastasis identificado sin embargo17,18,21. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado recientemente un nuevo en vivo caspasa biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar y rastrear las células que sobreviven apoptosis después de la activación de caspasas de19,46, el sello de apoptosis10,14. Distinción de los biosensores de caspasas "tiempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 que detecta actividad caspasa, el biosensor CaspaseTracker además cuenta con la capacidad para etiquetar permanentemente las células esa actividad caspasa expresa incluso transitoriamente. Por lo tanto, el biosensor CaspaseTracker permite seguimiento a largo plazo de anastasis después de reversión de caspase-mediada la célula muerte proceso in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (griego para "elevar a la vida") es un fenómeno de recuperación celular recientemente descubierto por el que mueren las células puede revertir procesos de muerte celular de fase que se asumen generalmente para ser intrínsecamente irreversible. Promoción de anastasis podría en principio rescate o preservación lesionado las células que son difíciles de reemplazar como cardiomiocitos o neuronas, facilitando la recuperación del tejido. Por el contrario, supresión de la anastasis en células de cáncer, que experimenta apoptosis después de terapias contra el cáncer, puede asegurar la muerte de la célula de cáncer y reducir las posibilidades de recurrencia. Sin embargo, estos estudios se han visto obstaculizados por la falta de herramientas para el seguimiento del destino de las células que experimentan la anastasis en animales vivos. El desafío es identificar las células que se han invertido el proceso de muerte celular a pesar de su aspecto morfológico normal después de la recuperación. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado Drosophila y mamíferos CaspaseTracker sistemas de biosensores que pueden identificar y rastrear permanentemente anastática células in vitro o en vivo. Aquí, presentamos en vivo los protocolos para la generación y uso del sistema CaspaseTracker doble biosensor para detectar y rastrear anastasis en Drosophila melanogaster después de la exposición transitoria a los estímulos de la muerte de la célula. Si bien biosensores convencionales y protocolos pueden etiquetar las células activamente en la muerte celular apoptótica, el biosensor CaspaseTracker puede etiquetar permanentemente las células que se han recuperado después de la activación de la caspasa - un rasgo distintivo de la etapa tardía de apoptosis, y al mismo tiempo identificar procesos apoptóticos activo. Este biosensor también puede seguir la recuperación de las células que otras formas de muerte celular que directa o indirectamente afectadas actividad caspasa. Por lo tanto, este protocolo nos permite seguir continuamente el destino de estas células y su progenie, facilitar futuros estudios de las funciones biológicas, mecanismos moleculares, las consecuencias fisiológicas y patológicas e implicaciones terapéuticas de Anastasis. También discutimos los controles adecuados para distinguir las células que se someten a anastasis que mostrar no apoptótica caspasa actividad in vivo.

Microscopía Celular en time-lapse es un método confiable para tracto anastasis en células cultivadas20, es difícil identificar que las células han sufrido anastasis en animales, porque las células recuperadas aparecen morfológicamente indistinguibles a las células sanas normales no han procurado la muerte celular. Por ejemplo, las células de cáncer de cérvix humano HeLa Mostrar características morfológicas de la apoptosis1,2<s...

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

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