Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Vi tackar Darren Obbard för Drosophila bilden i figur 3 c och video manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson och Heather M. Lamb för värdefull diskussion av detta manuskript. Detta arbete fick stöd av en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), dr Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright bevilja 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) och NCI K22 bevilja CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var Märtas och Kay Curci Foundation Fellow för Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

(1) förberedelse av CaspaseTracker Biosensor flugor
<ol><li>Söva flugor med CO2, och använda en pensel för att överföra 7 till 10 kaspas-känsliga Gal4 (DQVD)19 oskuld honor och 7 till 10 G-Trace53 Gal4 reporter unga manliga flugor (eller tvärtom) i samma injektionsflaskan med flyga mat och färsk jäst pasta. Obs: Kors av kaspas-känsliga (DQVD) Gal4 och G-Trace flugor kommer att producera CaspaseTracker avkomma flugor. Korsa av kasp...

Systemets CaspaseTracker dubbla biosensor är en ny och unikt verktyg som möjliggör detektering av senaste eller pågående kaspas aktivitet, och spårning av celler som har återförts celldöd och överleva efter att ha upplevt kaspas aktivitet i vivo. Medan kaspas verksamhet har traditionellt antagits som ett kännetecken för apoptos, visar växande studier att icke-apoptotiska kaspas aktivitet spelar potentiella roller i olika normala cellfunktioner, såsom reglering av ne...

Programmerad celldöd, såsom apoptos, spelar en viktig roll i embryonal utveckling och normala homeostas genom att eliminera oönskade, skadade eller farliga celler i flercelliga organismer1,2,3. Förlust av balans mellan celldöd och överlevnad kan leda till fatala konsekvenser såsom cancer, hjärtsvikt, autoimmunitet och degeneration4,5,6,7,8. Aktivering av bödeln kaspaserna har traditionellt betraktats som den ”point of no return” apoptos9,10,11, eftersom det utlöser snabba och massiva cellulära rivning12, 13,14,15,16. Utmanande denna allmänna dogm, visat vi att odlade döende primära celler och cancerceller kan återställa inte bara efter kaspas aktivering, men också följande viktiga cell death kännetecken inklusive plasmamembranet blebbing, cell krympning, mitokondriell fragmentering, frisläppandet av mitokondriell cytokrom c till cytosolen, kärnkraft och kromatin kondens, DNA-skador, nukleära fragmentering, cell surface exponering av Fosfatidylserin (PS) och bildandet av apoptotiska kroppar 17 , 18 , 19 , 20 , 21. vi föreslår att anastasis är ett inneboende cell återhämtning fenomen, som döende celler kan återhämta sig efter borttagning av cell death stimuli17,18,19,20, 21. vi myntade termen ”Anastasis” (Αναστάσης)18, vilket betyder ”rising till liv” på grekiska, till beskriva fenomenet oväntad cell återhämtning. Vår observation av anastasis stöds ytterligare av senaste oberoende studier som också avslöjar återvinning av celler efter fosfatidylserin externalisering22,23,24, begränsat mitokondriell yttre membran permeabilisering25, aktivering av blandade härstamning kreatinkinas-liknande (MLKL) och cell krympning26.
Karakterisera de mekanismer som reglerar anastasis får paradigm-shifting fysiologiska, patologiska och terapeutiska konsekvenser. Anastasis kan representera en tidigare okänd cytoprotektiva mekanism att rädda eller bevara viktiga postmitotic celler och vävnader som är svåra att ersätta, och möjligen konto för hjärtsvikt återföring av ventrikulära lossning med vänsterkammardysfunktion hjälpa enheter (LVADs)27,28, återvinning av ljusmätare celler efter övergående exponering av överdriven ljus29,30,31, eller reparation av nervceller efter hjärnan skada32. Om så att främja anastasis kunde förbättra cell- och återhämtning. Anastasis kan däremot vara en oväntad fly taktik används av cancerceller för att överleva cell-död-inducerande terapi, orsakar cancer återfall17,18. Därför undertrycka anastasis i döende cancerceller under och efter behandling av cancer kan vara en roman terapeutisk strategi att bota cancer genom att förhindra deras återfall.
Under processen för anastasis, har vi funnit att vissa återvunna celler förvärvat permanent genetiska förändringar och genomgick Onkogen transformation, sannolikt på grund av DNA-skador som uppstått under apoptos18,20,21 . Backning dödsprocessen DNA-skadade celler kan vara en mekanism för uppkomst, potentiellt bakomliggande iakttagelsen att upprepade vävnadsskada ökar risken för cancer i en mängd olika vävnader, såsom kronisk termisk skada i matstrupen inducerad av konsumtion av mycket varma drycker33,34,35, leverskador på grund av alkoholism36,37, tumör evolution efter genotoxiska cancer behandling38, 39,40, och utvecklingen av de nya cancerfallen från normal vävnad som uppstår under pauserna mellan cykler av cancerbehandling41,42,43,44 . Om sant, kunde inriktning anastasis hindra eller arrestera cancerutveckling och progression. Vi har funnit att svält-inducerad döende könsceller genomgår anastasis i åter fed Drosophila19.  Om anastasis sker i könsceller med DNA-skador, det konto för observationen att långvarig miljöbelastning främjar utvecklingen av genetiska sjukdomar. Exempelvis bidrar svältar till utvecklingen av transgenerationell ärftliga sjukdomar som diabetes och koronara hjärtsjukdomar45. Förståelse anastasis kan därför leda till strategier för att förebygga utveckling av ärftliga sjukdomar som orsakas av denna potentiella mekanism.
För att utnyttja upptäckten av anastasis och direkt kunna utveckla innovativa behandlingar, är det viktigt att studera orsak och konsekvens av anastasis i levande djur. Dock det tekniskt svårt att identifiera och spåra anastatic celler i vivo, eftersom cellerna som återhämtat sig från cell death process verkar morfologiskt oskiljbara från normala friska celler, och det finns ingen biomarkör för anastasis identifierade ännu17,18,21. För att lösa dessa problem, vi nyligen utvecklat ett nytt i vivo kaspas biosensor designerat ”CaspaseTracker”19, att identifiera och spåra celler som överlever apoptos efter kaspas aktiveringen19,46, den kännetecknande för apoptos10,14. Skilja det från ”realtid” kaspas biosensorer som SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 och iCasper52 att upptäcka pågående kaspas aktivitet, den CaspaseTracker biosensor har dessutom förmågan att permanent etikett celler express kaspas aktiviteten även övergående. Den CaspaseTracker biosensor kan därför långsiktigt spårning av anastasis efter återföring av kaspas-medierad cell death process i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (grekiska för ”rising till liv”) är ett nyligen upptäckt cell återhämtning fenomen där döende celler kan återföra sent stadium cell death processer som generellt antas vara oupplösligt irreversibel. Att främja anastasis kunde i princip undsättnings- eller bevara skadade celler som är svåra att ersätta exempelvis hjärtmuskelceller eller nervceller, vilket underlättar vävnad återhämtning. Omvänt, undertrycka anastasis i cancerceller, som genomgår apoptos efter anti-cancer terapier, kan säkerställa cancer celldöd och minska risken för återfall. Dessa studier har dock hindrats av bristen på verktyg för att spåra celler som genomgår anastasis i levande djur öde. Utmaningen är att identifiera de celler som har återförts cell dödsprocessen trots deras morfologiskt normala utseende efter återhämtning. För att övervinna denna svårighet, har vi utvecklat Drosophila och däggdjur CaspaseTracker biosensor system som kan identifiera och spåra permanent anastatic celler in vitro eller in-vivo. Här presenterar vi i vivo protokoll för generering och användning av CaspaseTracker dubbla biosensor systemet att identifiera och spåra anastasis i Drosophila melanogaster efter övergående exponering för cell death stimuli. Medan konventionella biosensorer och protokoll kan märka celler aktivt genomgår apoptotisk celldöd, den CaspaseTracker biosensor permanent kan märka celler som har återhämtat sig efter aktivering av kaspas - ett kännetecken för sent stadium apoptos, och samtidigt identifiera aktiva apoptotiska processer. Detta biosensor kan också spåra återvinning av de celler som försökt andra former av celldöd som direkt eller indirekt inblandade kaspas aktivitet. Därför detta protokoll gör det möjligt för oss att kontinuerligt följa dessa celler och deras avkomma, underlätta framtida studier av biologiska funktioner, molekylära mekanismer, fysiologiska och patologiska konsekvenserna och terapeutiska konsekvenser av öde Anastasis. Vi diskuterar också lämpliga kontroller för att skilja celler som genomgår anastasis från dem som visar icke-apoptotiska kaspas aktivitet in vivo.

Time-lapse levande cell mikroskopi är en tillförlitlig metod att tarmkanalen anastasis i odlade celler20, är det utmanande att identifiera vilka celler har genomgått anastasis i djur, eftersom de återvunna cellerna visas morfologiskt oskiljbara från normala friska celler som inte har försökt celldöd. Till exempel Visa mänskliga livmoderhalscancer HeLa cells morfologiska kännetecken för apoptos1,2,14...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis tekniskt utmanande för att upptäcka i vivo eftersom cellerna som återförts cell dödsprocessen kan vara morfologiskt oskiljbara från normala friska celler. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka och spåra celler som genomgår anastasis i levande djur genom att använda vår biosensor nyutvecklade i vivo CaspaseTracker system.

Att upptäcka Anastasis In Vivo av CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine muskelfunktion analys

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis

En forskningsmetod för att upptäcka Övergående myokardischemi hos patienter med misstänkt akut koronart syndrom Användning av kontinuerlig ST-segmentet analys

Each year, an estimated 785,000 Americans will have a new coronary attack, or acute coronary syndrome (ACS). The pathophysiology of ACS involves rupture ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI för Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Upptäcka avvikelser i Choroidal kärlsystemet i en musmodell av Åldersrelaterad makuladegeneration av Time-kurs indocyaningrönt angiografi

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal optisk avbildning<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av enda kärl Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Trigg Reaktiv Glios<em&gt; In Vivo</em&gt; Vid en framhjämeselektiv Stab skada

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation Microtumors Använda 3D Human Biogel odlingssystemet och patientgenererade glioblastomceller för Kinomic Profilering och läkemedelssvar Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...