Name: recording temperature-induced neuronal activity through monitoring calcium changes in the olfactory bulb of xenopus laevis
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis at JoVE.com

This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.

<ol>
	<li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures.">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li><li>Brechb&#252;hl, J., Moine, F., Broillet, M. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Grueneberg+ganglion+neurons+share+molecular+and+functional+features+with+C.+elegans+amphid+neurons.">Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons.</a> Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).</li><li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis.">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb.">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li><li>Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+correlation+imaging:+visualizing+function+and+structure+of+neuronal+populations.">Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations.</a> Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-controlled+device+for+the+application+of+odors+to+aquatic+animals.">A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals.</a> J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).</li><li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space.">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li><li>Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+cytoskeletal+elements+in+the+squid+giant+axon.">Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Calcium+Indicators.">Chemical Calcium Indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Salome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+using+acousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).</li><li>Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+imaging+for+systems+neuroscience.">Light-sheet imaging for systems neuroscience.</a> Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).</li><li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+silent+cells,+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks.">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die vorgestellten Methoden zielen hier bei der Aufzeichnung Temperaturverarbeitung im Riechkolben von Xenopus laevis Kaulquappen. Die Protokoll stains erster und zweiter Ordnung Neuronen im Bulbus olfactorius und stellt eine Probenvorbereitung in dem das olfaktorische System Wesentlichen intakt bleibt. Somit kann die Aktivierung des temperaturempfindlichen γ-Glomerulus überwacht und mit seiner chemoempfindlichen benachbarten Glomeruli verglichen werden. Das einzigartige bilaterale Innervation dieser Glomeruli wird durch Zelle Elektroporation mit spektral unterschiedlichen Farbstoffen sichtbar gemacht. Darüber hinaus ermöglicht Bolus Belastung für die Färbung von Mitralzellen ein großes Volumen innerhalb des Bulbus olfactorius überspannen. Die neuronalen Netzwerk-Verarbeitungstemperatur-induzierte Signale wird durch Einnahme von Kalziummessungen mit wiederholten Stimulus Anwendungen ergeben, und anschließend die Daten mit Aktivität Korrelation Bildgebung zu analysieren. Das Protokoll hebt zwei anspruchsvolle Färbung proce<html> Weisen, von denen beide vorsichtige Manipulation und Praxis erfordern, um zufriedenstellende und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Während der Elektroporation hat jede Verletzung der Tiere vermieden werden, vor allem, wenn die Elektroden in die Nase zu positionieren. Optimalerweise sollte kein Kontakt mit dem olfaktorischen Epithel auftreten. Beachten Sie, dass die Tiere leben noch nach der Elektroporation Verfahren und ihre Wiederherstellungszeit berücksichtigt werden. Wenn die Färbung nach einer Runde der Elektroporation zu schwach bleibt, die von den verwendeten Arten von Farbstoffen in Abhängigkeit passieren kann, kann seine Intensität durch Erhöhen der Farbstoffkonzentration in den Nüstern verbessert werden. Da Dextran-gekoppelter Moleküle über mehrere Mechanismen , einschließlich langsam axonalen Transport (bei ​​einer Geschwindigkeit von 1-2 mm / Tag 10) und passive Diffusion transportiert werden, ist eine weitere Alternative von 48 Stunden nach der Elektroporation zu warten , bevor die Tiere geopfert. Alternativ kann die Elektroporation kann nach einem Tag der Erholung wiederholt. jove_content &quot;&gt; Bolus Laden ist ein wichtiger Schritt, da die Menge an Farbstoff der Mitralzellen Eingabe schwierig zu regulieren und hängt von verschiedenen Parametern wie Pipettenspitze Größe und Lage der Anwendung. Die Überwachung des Verfahrens unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop erweist sich für nützlich zu sein Einstellen der Dauer des Farbstoffes Anwendung und somit Erzeugen ähnliche Färbungsergebnisse für Zubereitungen. Weiterhin zuvor elektroporiert Kaulquappen sollte durch die Identifizierung der Position des kleinen Cluster (bestehend aus der γ-Glomerulus), um die beste Position für den Farbstoff Anwendung bestimmt werden. die meisten kritische Schritt bei der Messung ist sowohl Verschiebung und Bleichen der Probe zu vermeiden. die Verschiebung kann durch eine sorgfältige Positionierung der Ringer Strom unter dem Mikroskop vermieden werden. Da das Bleichen der Bereich von Interesse zu begrenzen, sollte die Messzeit auf das wesentliche reduziert werden . Bolus Laden Färbung mit Calcium-sensitiven Farbstoffen bietet nur sehrgeringfügiger Kontrast, da die gesunden Zellen im Allgemeinen niedrige Kalziumkonzentrationen aufweisen und somit schwache basale Fluoreszenz. Aktivität Korrelation Imaging Anwendung umgeht diese Einschränkung durch Kontrast zu erzeugen basierend auf Aktivität und Highlights Strukturen mit ähnlichen Calcium-Signale. Diese nach dem Erwerb Analysemethode berechnet den Korrelationsfaktor zwischen dem Kalziumsignal eines ausgewählten Bereichs von Interesse (Referenzkurve), und dass jedes einzelnen Pixels in das 3D-Volumen. Daher sind die stark davon abhängen, erzielten Ergebnisse auf dem Aktivitätsmuster als Referenzspur ausgewählt. Wenn der Schwerpunkt Mitralzelle Innervationsmuster, ein Referenzsignal abgeleitet aus der spontanen neuronalen Aktivität zu visualisieren bevorzugt, und die aktivsten Mitralzellen dieser Wahl werden die besten Ergebnisse zu erzielen. Für die Chemo- oder thermosensitiven Netzwerke von Mitralzellen enthüllt, Referenzkurven nur entweder enthält Antworten Histidin oder kalt Ringer gewählt werden. Die Auswahl einer ganzen Glomerulus or Mitral Zellsoma als Region von Interesse kann nicht immer eine klare Referenzspur zur Verfügung stellen, vor allem, wenn die Strukturen auf die zwei verschiedenen Stimuli reagiert auf die aufeinander liegen. In einem solchen Fall ist es oft sinnvoll, eine kleinere Fläche des Glomerulus oder Zellkörper als interessierenden Bereich auszuwählen. In den letzten Jahrzehnten hat sich als ein effizientes Verfahren zum Anfärben einzelne oder mehrere Zellen 11,12 Elektroporation beschrieben. Hier wird es verwendet, speziell Neuronen Geruchsrezeptor zu beschriften. Dextran-konjugierten Moleküle geben die höchste Effizienz und für Nicht-Calcium - sensitiven Farbstoffen, die Bandbreite der Auswahl ist breit und deckt das gesamte Spektrum der Regel verwendet , in der Fluoreszenzmikroskopie 13. Jedoch Calcium-sensitiven Farbstoffen, die erfolgreich elektroporierten in Riechschleimhaut werden, sind im Moment Calcium-green Dextran beschränkt und Fluo-4 Dextran wenn noch im Handel erhältlich. Außerdem zielen die Aufnahmen in erster Linie superficial Schichten auf der ventralen Oberfläche des Riechkolbens nur, da die Eindringtiefe der schnellen Messtechniken begrenzt ist. Zwei-Photonen-Imaging kann teilweise diese Einschränkung zu überwinden, aber oft fehlt Geschwindigkeit und beschränkt die Menge der auswählbaren Calcium-sensitiven Farbstoffen weiter. Wir hier beschrieben ein Protokoll für die Temperatur-induzierte Aktivität im Riechkolben messen. Das Gehirn neuropil ist als ein dreidimensionales Volumen abgetastet, um die komplexen zellulären Netzwerke im olfaktorischen Verarbeitung von Temperatur beteiligt zu visualisieren. Messung von Temperatur-induzierten Aktivität im Riechkolben in jüngster 5 wurde berichtet , und erfordert eine speziell angepasste Verfahren die Kombination verschiedener Techniken. Ein großer Vorteil der Techniken, die oben dargestellt ist, dass Hunderte von Zellen in drei Dimensionen in einer Zubereitung abgebildet werden, wo der größte Teil des olfaktorischen Systems intakt bleibt. Diese Vorteile stellen hohe Anforderungen an die Färbetechniken sowie das Gehirn pWiedergutmachung und Bildgebung. Zum Beispiel Zelle Elektroporation und Bolus-Laden getroffen große Mengen von Zellen im Riechepithel und Birne und somit die Visualisierung von kompletten Mobilfunknetze ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Bereitstellung von chemischen Indikatoren via Bolus Laden statt genetisch codierten Fluorophore Messungen in einer potenziell größeren Satz von Arten. Andere Alternativen wie Bad Inkubation mit AM-Farbstoffe in erster Linie in Scheiben arbeiten, die stark die Riechkolben beschädigen, nur wenige hundert Mikrometer von intaktem Gewebe zu verlassen. Im Vergleich sorgt zum Beispiel der ganze Berg Vorbereitung in unserem Protokoll, dass die bilaterale Innervation des γ-glomerulus bleibt intakt und die Aufnahmen sind somit in einem nach wie vor Betriebssystem genommen. Schließlich ist die Bildgebung selbst wird durch Line-Beleuchtung Mikroskopie ermöglicht die Erfassung von 3D-Volumen durchgeführt. Line-Beleuchtung Mikroskopie ist eine der konfokalen Techniken , um die höchstmögliche Erfassungsraten bietet 6 &lt;/ Sup&gt;, die notwendig sind, einen großen Anteil des Riechkolbens zu bedecken. Langsamer Erfassungssysteme können verwendet werden, aber den Nachteil, dass die Größe des aufgenommenen Volumens reduziert werden muss. In den letzten Jahren wurden andere Verfahren für die schnelle Bildaufnahme entwickelt worden und können als Alternativen 14,15 verwendet werden. Dennoch Line-Beleuchtung Mikroskopie bleibt eine der einfachsten Methoden, sowohl ausreichend Geschwindigkeit und Auflösung zu gewinnen. Hier folgt einige Informationen als Richtlinien für geeignete Bildgebungs Setups auswählen. Da Kalzium-Imaging innerhalb von dicken Gehirn Vorbereitungen abgeschlossen ist, sollte die Einrichtung anständige konfokale bieten und die Ziele sollten numerische Aperturen von 1,0 oder höher aufweisen. Für einen Bezugspunkt genommen werden die Aufnahmen mit dem Linienbeleuchtung Mikroskop entsprechen Bilder mit einem Standard-Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Lochgröße von 0,5-1 luftig Einheiten gemacht. Schnelle Erfassungsgeschwindigkeit ist wünschenswert. Ein Volumen mit einer Dicke von 20 &amp; mgr; m von mindestens 5 l bedecktAyers, ein seitliches Sichtfeld von 100 um · 100 um und eine Pixelgröße von 0,5 um oder kleiner sollte bei einer Mindestgeschwindigkeit von 1 Hz pro Stapel gescannt werden. die Konfokalität Verringerung kann die Menge der Photonen gezählt erhöhen und ermöglicht somit schnellere Akquisitionen falls erforderlich, hat aber den Nachteil, mehr out-of-focus Licht aufgezeichnet wird. Da jedoch ein solcher Ansatz die Dicke der optischen Scheiben erhöht, kann es tatsächlich die Verfolgung von Dendriten durch verschiedene z-Ebenen nach der Anwendung von ACI 6 erleichtern. Die notwendigen Werkzeuge, um ausgiebig Temperaturverarbeitung in Bulbus olfactorius Netzwerke studieren hier vorgestellt. Temperatur-induzierte Aktivität in der ersten und zweiten Ordnung Neuronen über Calcium-sensitiven Farbstoffen und Signale sowohl einlaufen und aus dem γ-glomerulus aufgezeichnet. Darüber hinaus verarbeiten das Ausmaß, in dem einzelne Mitralzellen sowohl chemische als auch Temperaturinformationen beurteilt werden kann. Da die Vorbereitung leaves der Riechkolben intakt ist, kann die Rolle des bilateralen Innervation in der Duftverarbeitung weiter untersucht werden. Das Verfahren ist auch nützlich für enthüllt , ob und wie Thermo- und chemoinformation in überlappenden Netzwerken olfaktorischen 5 codiert wird. Schließlich können die oben erwähnten Techniken sind nicht auf die Untersuchung der Temperaturreaktionen in den Riechkolben begrenzt, sondern kann für eine allgemeine Bewertung des olfaktorischen Systems, insbesondere die Zellverarbeitungsnetzwerken in großen dreidimensionalen Volumina angewendet werden. Bolus Belastung und Aktivität Korrelation Bildgebung sind leistungsfähige Werkzeuge zu beobachten und die Aktivität von Dutzenden von Neuronen zu vergleichen, so dass sie für unterschiedliche Gehirnnetzwerken 16 zu machen.

Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the &#947;-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the &#947;-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the &#947;-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the &#947;-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the &#947;-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Reagents</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1064040500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1023820250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1058330250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">D(+)-Glucose</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1083371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Calcium Green 10 kDa Dextran</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">D-22914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">D-22911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:191px;">TEFlabs</td>
			<td>203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MK571</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td style="width:305px;">340-021-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS-222</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pluronic acid F-127</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">P2443</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">L-Histidine monohydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>53370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td>1029522500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Electronic pipette</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td style="width:305px;">HandyStep Electronic Repeating Pipette</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NiCr-Ni thermocouple</td>
			<td>Greisinger Elektronik</td>
			<td style="width:305px;">GTF 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:305px;">Model PC-10</td>
			<td>two-step puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Funnel applicator</td>
			<td>(Custom-made)</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Line-illumination microscope</td>
			<td>(Custom-made)</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td>otherwise, a commercially available spinning disk microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:305px;">441470-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:305px;">441452-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Software</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td>from R2010b upwards</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording temperature-induced neuronal activity through monitoring calcium changes in the olfactory bulb of xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Die Elektroporation von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN) wurde für anterograde Kennzeichnung über aktive axonalen Transport konjugiert mit Dextran-Moleküle mit Alexa Fluor Farbstoffe oder Calcium-Indikatoren. Während die ehemaligen Farbstoffe in der glomerulären Schicht der Zwiebel Verzweigung helle Färbung der sensorischen Neuronen und ihre Axonterminalen liefern, wobei letztere die Messung der neuronalen Aktivität in diesen Zellen (Abbildungen 1 und 2) zu ermöglichen. Zuerst wurde die Position des wärmeempfindlichen γ-Glomerulus und seine Innervationsmuster durch Elektroporation Alexa Fluor 647 Dextran und Alexa Fluor 546 Dextran in der linken und rechten olfaktorischen Epithels sichtbar, bzw. (1A). Vierundzwanzig Stunden nach dem Eingriff, die ORN in der Nase, die beiden Geruchsnerven und die Glomeruli in beiden Hemisphären waren unter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar. Die verschiedenen glomerulären Cluster waren identifiable von ihren jeweiligen Positionen, insbesondere die kleinen Cluster die γ-Glomerulus (1B) umfasst. Eine kleine Anzahl von Gegenriechfasern lief durch die kontralaterale Riechkolben, die vordere Kommissur gekreuzt und im ipsilateralen γ-Glomerulus (2A) beendet. Um Calciumantworten der präsynaptischen Fasern der γ-Glomerulus, Calcium Grün Dextran in ORNs wurde aufzuzeichnen elektroporiert, nach dem gleichen Verfahren. Negative Temperatursprünge am Nasenloch über die kontrollierte Freisetzung von eiskalter Ringerlösung induziert wurden (0-1 ° C). Ein 3D-Volumen, um die γ-glomerulus umfasst, wurde unter einer schnellen Linienbeleuchtung konfokalen Mikroskop abgebildet. &amp; Dgr; Ts von -1 ° C waren ausreichend kalt Antworten in der γ-Glomeruli und seine Afferenzen auszulösen, erkennbar als reversible Spitzen in den &amp; Delta; F / F Ca 2+ Spuren (2B &lt;/ strong&gt;, C). Weitere experimentelle Schritte durchgeführt wurden kalt induzierte Aktivität in den Mitralzellen auf die γ-glomerulus über ihre verästelte dendritische Endungen verbunden zu messen. Diese postsynaptischen Fasern und der umgebenden Neuropil wurden effektiv gefärbt durch Bolus Beladung des Calcium-sensitiven Farbstoff Fluo-08.00 Uhr durchgeführt , einige Tage nach Alexa 647 Dextran war in ORNs elektroporiert (3A, B). Mitral-Zellen wurden mit Fluo-08.00 Uhr gefüllt und das Riechepithel wurde zweimal nach folgendem Paradigma angeregt: kalt Ringer, Histidin (10 &amp; mgr; M) und Raumtemperatur-Ringer, angewendet anschließend. Zwei Referenzspuren wurden von interessierenden Bereichen in dem aufgenommenen Volumen entnommen, einer sich ausschließlich auf Temperatur Tropfen reagieren, die andere, nur Histidin. Aktivität Korrelation Bildgebung (ACI) 6 wurde auf dem ausgewählten Referenz berechnet basierendSpuren mit hohem Kontrast die dendritische Morphologie der postsynaptischen Netzwerke , die entweder auf die Temperatur oder den Histidin-responsive Ca 2+ -Signal (3C, D) sichtbar zu machen. Schließlich thermo und chemosensitiven Karten waren farbcodiert und überlagert auf der jeweils anderen, das zeigt , wie Temperatur und chemische Informationen an die olfaktorischen Neuronen zweiter Ordnung von einzelnen Glomeruli transportiert (Abbildung 3E). Für eine Beschreibung der Integration und Verarbeitung beider Arten von Informationen in gemeinsam genutzten olfaktorischen Netzwerke finden Sie Kludt et al. 5 <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> Abbildung 1: Übersicht über die ORN Elektroporation und Bolus - Laden (A) olfaktorischen Rezeptorneuronen in beide Nasenhöhlen von X.. laevis Larven wurden mit Alexa - Farbstoffe oder Calciu elektroporiertm-sensitiven Farbstoffen gekoppelt Dextranmoleküle. Die fluoreszierenden Indikatoren wurden anterograd bis zum Terminal axonalen arborization transportiert. 24 Stunden nach der Elektroporation, der glomerulären Schicht in beiden Hemisphären zeigte Fluoreszenzfärbung. (B) Schematische Darstellung der zellulären Organisation des Riechkolbens in einer Hemisphäre. Die glomeruläre Schicht erstreckt sich über die Lampe in Cluster: die medialen, kleine, mittlere und seitliche Clustern. Olfaktorischen Informationen werden aus den Rezeptorneuronen übertragen Zellen über Synapsen in Glomeruli Mitral. Periglomerular Zellen und Körnerzellen sind inhibitorischen Neuronen zu modulieren olfaktorischen Verarbeitung und Kodierung. Die γ-Glomerulus (cyan) wurde leicht als kleine Neuropil identifiziert, in denen ipsilateral (rot) und kontralateralen (orange) olfaktorischen Fasern verschmolzen. (C) Bolus - Beladung wurde in der Nähe des γ-Glomerulus erreicht postsynaptischen Neuropil zu färben , bestehend hauptsächlich aus Mitralzellen und deren dendritic Bäume deutlich in der glomerulären Schicht verzweigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> Abbildung 2: Elektroporation von ORN zeigt strukturelle und funktionelle Konnektivität (A) Bilaterale Innervation des γ-Glomeruli von ipsilateral (grün) und kontralateralen (rot) olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN).. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. (B) Die Riechkolben nach der Elektroporation mit dem Calcium-sensitiven Farbstoff Calcium Grün Dextran. Die inter (IMC), medial (MC) und die kleine Cluster (SC) sind sichtbar. Das Bild ist eine maximale Projektion von 100 &amp; mgr; m dicken Messvolumen. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. (C) Nahaufnahme des kleinen Cluster. Das aufgenommene Volumen (12 &amp; mgr; m) istin einem maximalen Projektion dargestellt. Das Bild zeigt die basale fluoreszierenden Ebene in grau und die farbkodierte &amp; Delta; F / F Karte als Overlay. Die maximale Reaktion auf die Stimulation mit kaltem Ringer-Lösung aufgetragen. Die γ-glomerulus reagierte stark, während die beiden benachbarten Glomeruli schweigen. Der Einschub zeigt die AF / F-Trace für die γ-Glomeruli an die angegebene Region von Interesse entspricht. Der blaue Balken steht für die Reizapplikation. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> Fig . 3: Bolus Laden und ACI Wärmeempfindliches und chemosensitiven Netzwerke dissoziieren (A) von Axons ORNs im kleinen Cluster beendet wurden durch Elektroporation mit dem nicht-gefärbten calcium empfindlichen Farbstoff Alexa 647 Dextran. Die gestrichelte Linie zeigt die γ-Glomeruli. (B) Bild des gleichen Bereichs wie in (A) in den zweiten Messkanal nach Bolus - Beladung mit dem Calcium-sensitiven Farbstoff Fluo-8 Uhr. Einige Mitralzelle somata waren sichtbar, aber der Kontrast war begrenzt. Nach den Pfeilen wurden zwei Antwortspuren aufgezeichnet, die für die Aktivität Korrelationsabbildung (ACI) verwendet wurden. Blau, rot und schwarzen Balken unterhalb der Spuren zeigen den Beginn der Anwendung von Kälte Ringer, Histidin (10 uM) und Raumtemperatur-Ringer als negative Kontrolle, respectively. Die zwei Ca 2+ Spuren wurden aus verschiedenen Regionen von Interesse des gemessenen Volumens genommen. (C) Das ACI Ergebnis der Spur in (B) hervorgehobene Bereiche überwiegend zu kalt Ringer reagieren. (D) Die ACI Ergebnis der Spur in (B) hervorgehobene Bereiche überwiegend auf Histidin reagiert. (E) Überlagerung der beiden ACI - Karten. Mitral-Zellen h reagierenistidine und die Innervation glomerulus (rot) waren leicht von thermisch empfindlichen Mitralzellen und der γ-Glomerulus (cyan). Alle Bilder dieser Figur sind maximale Intensität Projektionen eines 28 um dicken Volumen. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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