Name: complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis at JoVE

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من منح المعاهد الوطنية للصحة (DP2OD007447، R01GM110174 وR01AI118891).

<ol>
	<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canalization+of+development+and+the+inheritance+of+acquired+characters.">Canalization of development and the inheritance of acquired characters.</a> Nature. 150, 563-565 (1942).</li><li>Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+cancer.">Epigenetics in cancer.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 27-36 (2010).</li><li>Reik, W., Dean, W., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+mammalian+development.">Epigenetic reprogramming in mammalian development.</a> Science. 293 (5532), 1089-1093 (2001).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Tessarz, P., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+core+modifications+regulating+nucleosome+structure+and+dynamics.">Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 703-708 (2014).</li><li>Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+and+chromatin+cross-talk.">Histone and chromatin cross-talk.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (2), 172-183 (2003).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+histone+crosstalk.">The language of histone crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Simboeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Phosphorylation+Switch+Regulates+the+Transcriptional+Activation+of+Cell+Cycle+Regulator+p21+by+Histone+Deacetylase+Inhibitors.">A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors.</a> J Biol Chem. 285 (52), 41062-41073 (2010).</li><li>Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+serine+10+phosphorylation+by+Aurora+B+causes+HP1+dissociation+from+heterochromatin.">Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin.</a> Nature. 438 (7071), 1176-1180 (2005).</li><li>Xhemalce, B., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromodomain+switch+mediated+by+histone+H3+Lys+4+acetylation+regulates+heterochromatin+assembly.">A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly.</a> Genes Dev. 24 (7), 647-652 (2010).</li><li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers.">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142 (6), 967-980 (2010).</li><li>van Attikum, H., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+histone+modifications+during+the+DNA+damage+response.">Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response.</a> Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+is+required+for+chromatin+remodeling+and+inactivation+of+sex+chromosomes+in+male+mouse+meiosis.">H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis.</a> Dev Cell. 4 (4), 497-508 (2003).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> Embo J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics:+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry.">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li><li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Shotgun+Quantitative+Mass+Spectrometry+Characterization+of+Histones.">One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li><li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawbacks+in+the+use+of+unconventional+hydrophobic+anhydrides+for+histone+derivatization+in+bottom-up+proteomics+PTM+analysis.">Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis.</a> Proteomics. 15 (9), 1459-1469 (2015).</li><li>Lin, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+histone+posttranslational+modification+patterns+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).</li><li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWATH+Analysis+for+Characterization+and+Quantification+of+Histone+Post-translational+Modifications.">SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications.</a> Mol Cell Proteomics. , (2015).</li><li>Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SAHA-Dependent+Changes+in+Histone+Modifications+Using+Data-Independent+Acquisition+Mass+Spectrometry.">Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. , (2015).</li><li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiProfile+Quantifies+Histone+Peptides+With+Modifications+by+Extracting+Retention+Time+and+Intensity+in+High-resolution+Mass+Spectra.">EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+proteomic+search+engines+for+the+analysis+of+histone+modifications.">Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications.</a> J Proteome Res. 13 (10), 4470-4478 (2014).</li><li>Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylated+histone+H3K56+interacts+with+Oct4+to+promote+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency.">Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11493-11498 (2013).</li><li>Vonholt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Histones.">Isolation and Characterization of Histones.</a> Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).</li><li>Zhang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+acetylation+and+methylation+sites+of+histone+H3+from+chicken+erythrocytes+by+high-accuracy+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time-of-flight,+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-postsource+decay,+and+nanoelectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 306 (2), 259-269 (2002).</li><li>Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Variants+and+Their+Post-Translational+Modifications+in+Primary+Human+Fat+Cells.">Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells.</a> Plos One. 6 (1), e15960 (2011).</li><li>Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+different+mass+spectroscopic+techniques+for+the+analysis+of+dynamic+changes+of+histone+modifications.">A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications.</a> Proteomics. 4 (5), 1382-1396 (2004).</li><li>Zhao, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Post-translational+Modifications+upon+Ischemia/Reperfusion-Induced+Retinal+Injury.">Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury.</a> J Proteome Res. 13 (4), 2175-2186 (2014).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope-labeled+histone+peptide+library+for+histone+post-translational+modification+and+variant+quantification+by+mass+spectrometry.">Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2450-2466 (2014).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

هو الأمثل بروتوكول صفها هنا النظر في التكاليف والوقت والأداء. استعدادات أخرى ممكنة، ولكن لديهم قيود، وخاصة في حالة اقتران مع تحليل MS. على سبيل المثال، بروتوكول استخراج عالية من الملح يمكن أن تستخدم لتنقية الهستونات 26 بدلا من هطول TCA (القسم 3). بروتوكول عالية من الملح أكثر اعتدالا في جوهرها، كما أنه لا يستخدم حمض قوي. هذا يحفظ PTMs حمض عطوب ويزيد من العائد من الهستونات المستخرج، كما TCA هطول المشارك يترسب العديد من البروتينات الأخرى لونين ملزمة. ومع ذلك، واستخراج عالية من الملح يؤدي إلى عينات تحتوي على الملح مركزة للغاية بالنسبة HPLC-MS / MS. في إعداد بديل، والهضم هيستون يمكن القيام بها دون propionylation (القسم 6-8)، على سبيل المثال من خلال تقليل الوقت التربسين الحضانة ونسبة انزيم / الركيزة 27 أو باستخدام ARGC كما انزيم الهضم 28-30. ومع ذلك، فمن المستحسن اشتقاق مع أنهيدريد البروبيونيك، وأنار يؤدي إلى توليد المزيد من الببتيدات مسعور، والتي يتم الاحتفاظ بشكل أفضل خلال اللوني السائل. لاشتقاق الكيميائية، تم تقييم مجموعة متنوعة من المركبات الحمضية اثنين من الأحماض العضوية ومزاياها مناقشة شاملة 18. ومع ذلك، أثبتت أنهيدريد البروبيونيك إلى أفضل حل وسط بين الكفاءة والمنتجات الجانبية الحد الأدنى وتحسين للا مائية الببتيد. يحتمل، أنهيدريد البروبيونيك يمكن شراؤها في شكل المسمى isotopically. وهذا يسمح للتحليل الإرسال المتعدد نظرا لإمكانية خلط عينات متعددة وتميز على الصعيد MS على أساس كتل مختلفة المنقولة من التسمية الثقيلة. ومع ذلك، هذا التحليل يؤدي إلى زيادة تعقيد اللوني LC-MS ويقلل من كمية العينة التي يمكن حقنها في كل حالة واحدة. وفي هذا الصدد، ينبغي إبراز بعض الجوانب الهامة من البروتوكول. وينبغي أن تستخدم ما يلي كما الفصلecklist إلى العثور على أخطاء في تنفيذ الإجراء في حال الحصول على نتائج سلبية. أولا، بعد هطول الأمطار أنويتها يجب غسلها بيليه بعناية مع بنك الاستثمار القومي دون (القسم 2.10) حتى الاستئصال الكامل للمنظفات (ملحوظ بسبب عدم وجود فقاعات خلال خلط) NP-40 البديل. ان الفشل في القيام بذلك تنازلات استخراج هيستون مع الأحماض. ثانيا، بعد هطول الأمطار هيستون مع TCA (القسم 3.9) يغسل بيليه مع الأسيتون أمر بالغ الأهمية. ان وجود حمض المركزة تضر الخطوة التالية إذا يتم تنفيذ propionylation والهضم (القسم 6.1) مباشرة. وسيكون من لا مشكلة في تجزئة القضية هيستون يتم تنفيذ (القسم 5). ثالثا، من الضروري أن رد الفعل propionylation تتم بسرعة (قسم 6،3-6،7). للقيام بذلك، تجنب استخدام مزيج propionylation نفسه (أنهيدريد البروبيونيك + الأسيتونتريل) لأكثر من 3-4 عينات متتالية. بالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة هو الجانب الأكثر أهمية في عملية الهضم التربسين (المادة 7). ان لمحول 8.0 (7،5-8،5) ستكون عملية الهضم غير فعالة. هذا يمكن أن يحدث، كما العينة سوف تكون غنية في حمض البروبيونيك في هذه الخطوة. NH 4 OH يمكن إضافة حتى لزم الأمر. أيضا، للباحثين على دراية سير العمل البروتينات وسوف تشعر الطبيعي أن يحمض عينة لإنهاء التربسين الهضم. لا ينبغي أن يتم هذا، لأنها سوف يعرض للخطر التفاعل التالي، أي propionylation الببتيد N-ترميني (القسم 8.1). وأخيرا، في نفس القضية، من المهم أن نتذكر لتحليل البيانات أن الببتيدات معدلة ليست معدلة في الواقع. جميع سيتم المحتلة بقايا يسين مجاني وN-ترميني من propionylation (56،026 دا). وهكذا، وأداء استخراج اللوني ايون من كتلة المقابلة فريد لتسلسل الببتيد من شأنه أن يؤدي إلى أية نتائج. القيود المفروضة على طريقة هي في معظمها ذات الصلة إلى عدم القدرة على اكتشاف PTMs اندماجي، ويرجع ذلك إلى تسلسل الببتيد قصيرة، والتحيز في تحقيق أبون صحيحرقصة التعديل، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الببتيدات في أشكال معدلة مختلفة قد تأيين مع كفاءات مختلفة. العدد الأول يمكن حلها عن طريق الجمع بين هذه التقنية مع لأسفل المتوسط ​​أو نهج من أعلى إلى أسفل (التي استعرضت في 16). هذا النوع من التحليل، حتى لو كان من الناحية الفنية أكثر تحديا، مثالية لدراسة الترددات التعايش بين التعديلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح بالتمييز أفضل من المتغيرات هيستون، الذي لا يمكن أن يتحقق دائما مع القاعدة إلى القمة منذ بعض الببتيدات لديها نفس تسلسل في المتغيرات هيستون مختلفة. المسألة الثانية، تتعلق كفاءة التأين، يمكن حلها باستخدام مكتبة من الببتيدات الاصطناعية 31. هذا النهج يضمن تقدير أكثر دقة من الوفرة النسبية للPTMs هيستون. ومع ذلك، في معظم التجارب، والنتيجة المرجوة هي التغيرات النسبية من تعديلات معينة بين الظروف تحليلها. في هذه الحالة، هذا التصحيح ليس من الضروري، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن جميع العينات لها نفس بياالصورة. في الختام، يسمح هذا البروتوكول لتحليل PTMs هيستون الذي يمكن أن تكتمل في 3 أيام باستخدام NLC بالإضافة إلى بالترادف MS. مقارنات مع غيرها من التقنيات من مرض التصلب العصبي المتعدد، أي باستخدام استراتيجيات الأجسام المضادة تستند كما جاء في المقدمة، ليست مناسبة، لأنها لا يمكن أن تحقق حتى ما يقرب من هذا المستوى من الإنتاجية. وبالإضافة إلى ذلك، وتقنيات الأجسام المضادة على أساس لا تسمح لاكتشاف تعديلات جديدة، لكنها تستند حصرا على تأكيد وقياس العلامات المتوقعة. وبالتالي فإننا نفترض أن البروتينات أسفل إلى أعلى على الببتيدات هيستون سوف تكسب شعبية في المختبرات البروتينات نظرا لمزايا بديهية في معرفة تنظيم علامات هيستون، والتي هي أبطال في التعبير ضبط الجينات، وبالتالي تؤثر على تنظيم بروتيوم. وعلاوة على ذلك، وصفت البروتوكول يشمل التحسينات الأخيرة في إعداد العينات والبرمجيات لتحليل البيانات، مما يجعل تحليل هيستون أكثر تافهة أيضا للمختبرالمحافظين الذي لم يشهد توصيف هذا النوع من الببتيدات hypermodified.

ويعرف علم التخلق مثل دراسة التغيرات الموروثة في التعبير الجيني التي تنشأ عن طريق آليات أخرى من تغيير الأساسي تسلسل الحمض النووي 1. تنظيم جينية أمر بالغ الأهمية خلال التنمية باعتبارها كائن يخضع المظهرية مثيرة يتغير على الرغم من أن لا يتم تغيير محتوى الحمض النووي. وهناك العديد من العناصر الأساسية اللازمة لصيانة جينية المناسبة، بما في ذلك هيستون التعديلات بعد متعدية (PTMs)، المتغيرات هيستون، الرنا غير الترميز، الحامض النووي والعوامل الحمض النووي ملزم، كل منها يؤثر على التعبير الجيني من خلال آليات مختلفة 2. على سبيل المثال، في حين الحامض النووي هو تعديل درجة عالية من الاستقرار الذي يقمع ترجمة الجينات 3، المتغيرات هيستون وPTMs هيستون أكثر ديناميكية بكثير، ويمكن أن تؤثر على لونين في مجموعة متنوعة من الطرق (4). يتم ترجمة PTMs هيستون في الغالب على ذيول-N محطة، لأنها المنطقة الأكثر تعرضا ومرنةمن البروتين. ومع ذلك، يتم تعديل جوهر جسيم نووي أيضا بشكل كبير مقارنة بمتوسط ​​البروتينات 5. على الرغم من علامات هيستون اتسمت على نطاق واسع في العقد الماضي، العديد من الروابط بين علامات هيستون المعروفة وظيفتها لا تزال غير واضحة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم PTMs هيستون لا تعمل وحدها، وإنما وظيفة جنبا إلى جنب مع PTMs الأخرى ( &quot;عبر الحديث&quot;) لتغيير عملية معينة مثل النسخ 6،7 هذا. على سبيل المثال، علامة H3S10K14ac اندماجي على P21 الجين ينشط النسخ، والذي لن يحدث مع واحد فقط من اثنين من PTMs 8. التعاقدات البروتين HP1 لونين من خلال الاعتراف H3K9me2 / ME3 ونشر تعديل جسيم نووي قريب. ومع ذلك، HP1 لا يمكن ربط H3K9me2 / 3 عندما S10 المجاور هو فسفرته 9. أستلة H3K4 يمنع الارتباط من spChp1 البروتين لH3K9me2 / ME3 في pombe السكيراء 10. وعلاوة على ذلك، فإن هيستون يسين دemethylase PHF8 لديها أعلى جسيم نووي كفاءة ملزمة عندما تكون موجودة 11 ثلاثة PTMs H3K4me3، K9ac، وK14ac. هذه الأمثلة تبرز أهمية تحقيق نظرة شاملة للتغيرات PTM هيستون بدلا من التركيز على التعديلات واحدة. وجود تسلسل المتغيرات أيضا يزيد من تعقيد تحليل هيستون، كما فعل isotypes هيستون عموما تسلسل مشابهة إلى حد كبير، ولكن في كثير من الأحيان أدوارا مختلفة في لونين. على سبيل المثال، H2A.x لديه تسلسل C-المحطة التي فسفرته أكثر سهولة على الحمض النووي من التلف مقارنة H2A الكنسي 12، وكان مطلوبا لتثبيط الكروموسومات الجنسية في الذكور الماوس الانقسام الاختزالي 13؛ وبالمثل، CENP-A بدائل H3 هيستون الكنسي في القسيم 14. وعلى الرغم من وظائفهم مختلفة، وهذه المتغيرات تشترك في جزء كبير من تسلسل الأحماض الأمينية مع هيستون الكنسي منها، مما يجعل من الصعب تحديد وقياس كل منها على حدة. </p&gt; وقد تم اعتماد التقنيات المعتمدة الأجسام المضادة مثل النشاف الغربي على نطاق واسع لوصف الهستونات. ومع ذلك، والنهج القائم على الأجسام المضادة محدودة للأسباب التالية: (أ) يمكن أن تؤكد فقط وجود تعديل ولا يمكن تحديد PTMs غير المعروفة؛ (ب) ومنحازة بسبب وجود علامات موجودة المشترك، والتي يمكن أن تؤثر على تقارب ملزم. (ج) لا يمكن تحديد علامات اندماجي، كما ليست سوى عدد قليل جدا من الأجسام المضادة المتاحة لهذا الغرض و (د) عبورهم في رد الفعل بين المتغيرات هيستون مماثلة إلى حد كبير أو PTMs مماثلة (على سبيل المثال، دي وtrimethylation من بقايا يسين). Egelhofer وآخرون. وصف أن أكثر من 25٪ من الأجسام المضادة التجارية تفشل الإختبارات خصوصية لطخة نقطة أو لطخة غربية، وبين الاجسام المضادة المحددة تفشل أكثر من 20٪ في التجارب مناعي لونين 15. مطياف الكتلة (MS) هو حاليا أداة تحليلية أكثر ملائمة لدراسة الرواية و / أو اندماجي PTMs،وكان قد تم تنفيذها على نطاق واسع للبروتينات هيستون (إعادة النظر في 16). هذا يرجع في معظمه إلى حساسية عالية ودقة الجماعية لمرض التصلب العصبي المتعدد، وإمكانية لإجراء تحليلات واسعة النطاق هذا. استراتيجية من أسفل إلى أعلى هي الأكثر استخداما استراتيجية البروتينات يستند إلى MS-لتوصيف هيستون وPTMs بهم، حيث يتم هضم البروتين سليمة إنزيمي في الببتيدات قصيرة (5-20 أأ). هذا الهضم يسهل على حد سواء فصل LC والكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. الجماهير في حدود 600 - 2000 دا يشيع المتأين أكثر سهولة وحددت بدقة أعلى الجماعية وقرار من الجماهير الكبيرة. تم تحسين MS / MS تجزئة أيضا، كما هي عادة مناسبة تماما الببتيدات القصيرة للتصادم الناجم عن تفكك (CID). ومع ذلك، الهستونات تحديا لمن أسفل إلى أعلى MS كما هي التخصيب في مخلفات الأحماض الأمينية الأساسية، وهي يسين وأرجينين. لذلك، والهضم التربسين يؤدي إلى توليد الببتيدات التي هي أيضا SMجميع من أجل الاحتفاظ LC والتعريب لا لبس فيه من PTMs. للتحايل على هذه المسألة، ويتضمن بروتوكول لدينا ليسين والببتيد-N محطة الكيميائية اشتقاق 17. من المستحسن استخدام الخل البروبيونيك لكفاءة اشتقاق الكيميائية بالمقارنة مع الكواشف الأخرى 18. هذه القطع اشتقاق الفئات-ɛ الأمينية من بقايا يسين معدلة وmonomethyl، مما يسمح للالتربسين لأداء التحلل البروتيني فقط في C-محطة من بقايا أرجينين. الأمينات Derivatized لا يمكن تبادل البروتونات مع الحل، وبالتالي يتم عادة إلا مضاعفة أو ثلاثة أسباب اتهم الببتيدات، وتسهيل التصلب العصبي المتعدد والكشف MS / MS. وعلاوة على ذلك، اشتقاق N-محطة يزيد للا مائية الببتيد ومرحلة عكس بالتالي الاحتفاظ الكروماتوغرافي. هنا، نحن تصف سير العمل لتنقية الهستونات وإعدادهم للتحليل PTM عبر البروتينات من أسفل إلى أعلى (الشكل 1). هذه الاستراتيجية تحقق القياس الكمي للعلامات هيستون واحدة وعلامات اندماجي وأو PTMs هيستون التي هي قريبة نسبيا في تسلسل الأحماض الأمينية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td style="width:217px;">For harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Tris</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Calcium Chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">DTT</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">AEBSF</td>
			<td style="width:157px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:151px;">101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Microcystin</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M4194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sodium Butyrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">NP-40 Alternative</td>
			<td style="width:157px;">CALBIOCHEM</td>
			<td style="width:151px;">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sulfuric Acid, ACS grade</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Acetone</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:157px;">Biorad</td>
			<td style="width:151px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">30% acrylamide/bis 29:1 -- 500ml</td>
			<td style="width:157px;">Biorad</td>
			<td style="width:151px;">1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Coomassie</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm</td>
			<td style="width:157px;">Grace</td>
			<td style="width:151px;">218TP52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm</td>
			<td style="width:157px;">Grace</td>
			<td style="width:151px;">218TP54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">TFA</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">propionic anhydride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">240311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">PRV5113</td>
			<td>For digesting histones for MS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 extraction disk</td>
			<td style="width:157px;">Empore</td>
			<td style="width:151px;">2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis

جسيم نووي هي أصغر وحدة الهيكلية للونين، ويتألف من 147 زوج قاعدي من الحمض النووي ملفوفة حول وجود octamer من البروتينات هيستون. وتتوسط وظيفة هيستون من تعديلات واسعة النطاق بعد متعدية من قبل عدد لا يحصى من البروتينات النووية. هذه التعديلات هي الحاسمة للسلامة النووية كما أنها تنظم لونين هيكل وتجنيد الأنزيمات المشاركة في تنظيم الجينات، وإصلاح الحمض النووي والتكثيف كروموسوم. على الرغم من أن جزءا كبيرا من المجتمع العلمي تتبنى التقنيات المعتمدة الأجسام المضادة لتوصيف هيستون PTM وفرة، وهذه الطرق هي منخفضة الإنتاجية ومنحازة ضد بروتينات hypermodified، كما يمكن أن يعرقل حاتمة من التعديلات المجاورة. يصف هذا البروتوكول استخدام اللوني نانو السائل (مؤتمر العمل النيجيري) ومطياف الكتلة (MS) لتقدير دقيق للتعديلات هيستون. تم تصميم هذا الأسلوب لوصف مجموعة كبيرة ومتنوعة من PTMs هيستون والوفرة النسبية لعدد من المتغيرات هيستون في الصورةيحلل إنجل. في هذا البروتوكول، وderivatized الهستونات مع أنهيدريد البروبيونيك تليها الهضم مع التربسين لتوليد الببتيدات من 5-20 أأ في الطول. بعد الهضم، وderivatized المكشوفة حديثا N-ترميني من الببتيدات هيستون لتحسين معدلات الاحتفاظ الكروماتوغرافي خلال مؤتمر العمل النيجيري-MS. وتسمح هذه الطريقة لتقدير النسبي للPTMs هيستون تمتد أربع درجات.

وكمثال على ذلك، قمنا بتحليل الهستونات المستخرجة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مع أو بدون حمض الريتينويك (RA) التحفيز، بدءا من 200 الكريات خلية ميكرولتر. وجود التهاب المفاصل الروماتويدي في زراعة الخلايا يؤدي إلى ESC التمايز. من بيليه الخلية، حول 50-100 ميكروغرام من الهستونات انتزعت، التي هي أكثر من كافية لأداء عدة حقن LC-MS من الببتيدات هيستون. بعد اشتقاق، والهضم، وتحلية، تم تحميل العينات على 75 ميكرومتر × 15 سم C 18 عمود (الجسيمات قطرها 3 ميكرون، حجم المسام 300 Å) في وضع تسلسلي مع ارتفاع أداء نظام السائل نانو اللوني مع رقائق ميكروفلويديك بالإضافة إلى هجين خطي فخ رباعي - مطياف الكتلة orbitrap. تم تنفيذ الاستحواذ MS باستخدام مطار دبي الدولي. في موازاة ذلك، تم تحليل عينات أيضا مع طريقة إدارة شؤون نزع السلاح باستخدام UHPLC النانو تدفق بالإضافة إلى هجين أيون مطياف الكتلة فخ orbitrap (لا تظهر البيانات). فيكل دورة، تم تنفيذ واحد كشف MS orbitrap الكامل مع مسح مجموعة من 290 إلى 1400 م / ض، وهو قرار من 60،000 (في 200 م / ض) و AGC من 10 6. وبعد ذلك، تم تطبيق البيانات وضع اكتساب تعتمد مع ديناميكية استبعاد 30 ثانية. وتلت بمسح MS / MS على أيونات الأم من أكثرها كثافة. تم استبعاد أيونات مع ولاية تهمة واحدة من MS / MS. تم استخدام نافذة عزل 2 م / ض. كانت مجزأة أيونات باستخدام الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) مع الطاقة اصطدام 35٪. كان يستخدم أيون كشف مصيدة مع وضع مجموعة المسح العادي ومعدل المسح العادي مع AGC من 10 4. وقد تم تحليل البيانات الخام MS اعتماد برنامج لاستخراج السلائف والأيونات جزء الاستشرابية، وهي أفق 23 و 22 EpiProfile. وقد تم تحسين EpiProfile لالببتيدات هيستون، كما أنه يدمج ذكي استخراج الذروة المنطقة بسبب معرفة سابقة من الحماسيالمد الوقت الاحتفاظ. من ناحية أخرى، هو الأمثل الأفق لتحليل DIA، وبالتالي فإن الأرقام DIA عرض (الأرقام 4 و 5A) ولقطات من هذا البرنامج. من اللوني ايون المستخرج، يتم استرداد المنطقة تحت المنحنى، وهذا يستخدم لتقدير وفرة من كل الببتيد. تم حساب منطقة ذروة الكروماتوغرافي لل[M + H] + [M + 2H] 2+، و[M + 3H] 3+ أيونات الببتيد نفسه، حتى وإن كان في معظم الحالات [M + 2H] 2+ كان الشكل السائد. وهذا يوفر وفرة الخام من شكل معدل معين من الببتيد. من أجل تحقيق الوفرة النسبية للPTMs، اعتبر مجموع كل أشكال معدلة مختلفة من الببتيد هيستون إلى 100٪، وقسمت المنطقة من الببتيد معين من المساحة الإجمالية لهذا الببتيد هيستون في جميع أشكاله المعدلة . الببتيدات هيستون موجودة في فا<html> riety من أشكال إسوي الضغط (الشكل 5). الببتيدات إسوي الضغط، على سبيل المثال، K18ac وK23ac، لا يمكن إلا أن يكون كميا على مستوى MS / MS، حيث يتم استخدام أيونات جزء فريدة من نوعها لتحديد نسبة الأنواع إسوي الضغط (الشكل 5A و5B). وتستخدم هذه النسبة إلى تقسيم منطقة ذروة الكروماتوغرافي بين النوعين. عند استخدام السلاح، وقد أدرجت هذه الأشكال إسوي الضغط في قائمة الجماهير المستهدفة، لأن هذه الببتيدات يجب اختيارها للتجزئة من خلال شطف لهم بأكمله، وهو ما لا يحدث في تجربة السلاح القياسية. التمييز من الوفرة النسبية للأنواع إسوي الضغط ثم يتم تنفيذ من خلال مراقبة البيانات الشخصية شطف من الأيونات شظية. من ناحية أخرى، نوع DIA الاستحواذ لا يتطلب أي قائمة إدراج. ومع ذلك، فإن هذا النوع من طريقة الشراء غير متوافق مع البحث في قاعدة البيانات التقليدية، وبالتالي قد تحول دون اكتشاف الببتيدات غير معروفة تعديلها. الحمار = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; والتمييز يسين أستلة (+ 42،011 دا) من trimethylation إسوي الضغط تقريبا (+ 42،047 دا) باستخدام عالية الدقة MS الاستحواذ (&gt; 30000). وعلاوة على ذلك، أستلة أكثر مسعور من trimethylation، مما يؤدي إلى شطف من الببتيد الأسيتيل في وقت لاحق من تلك trimethylated منها. شكل معدلة من نفس الببتيد elutes حتى وقت لاحق، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ليسين وpropionylated. وباختصار، فإن ترتيب للا مائية لالببتيد مع موقع واحد قابل للتعديل هو عرق وtrimethylated &lt;الأسيتيل &lt;معدلة (propionylated) &lt;monomethylated (propionylated). وأظهرت hESCs انخفاض واضح من الببتيدات الأسيتيل عندما حفز للتمايز (الشكل 6A و 6B). وهذا لم يكن مفاجئا، كما أفادت النتائج السابقة أعلى أستلة في المجالس الاقتصادية والاجتماعية بالمقارنة مع التفريق منها 25،يعكس الطبيعة المتساهلة عموما من لونين المحفزة. من خلال التركيز على H3 هيستون، وتم قياس كمية 35 أشكال معدلة مختلفة (الشكل 6C). ومع ذلك، كل proteoforms هيستون التي يمكن أن يتم التحقيق مع هذا النهج أكثر من 200، بما في ذلك جميع المتغيرات هيستون والتعديلات وفرة منخفضة (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، أظهر تحليلنا أن استنساخ عالية يمكن الحصول عليها بين مكررات التقنية، كما يدل على ذلك حجم صغير من أشرطة الخطأ (تمثل ± الانحراف المعياري). معا، ويصف هذا القسم كيفية استخراج الوفرة النسبية من الببتيدات هيستون تعديلها باستخدام بيانات NLC-MS. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> الشكل 1: سير العمل من أسفل إلى أعلى MS / MS تحليل هيستون ويبين الخطوات العشر لتحليل هيستون، بما في ذلك تقدير الوقت اللازم لكل خطوة.<html> ونظرا للعدد القسم بين قوسين أنها موجودة في المخطوطة. القسم 5، واصفا عينة تجزئة لعزل مختلف المتغيرات هيستون، يمكن إغفال ما لم يكن هناك حاجة لتحليل حساسة للغاية من البديل معين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> الشكل 2: عكس المرحلة العليا تدفق LC للهيستون البديل تجزئة وCoomassie جل (A) اللوني LC-الأشعة فوق البنفسجية تمثل الفصل هيستون سليمة. المتغيرات هيستون H3 يمكن تمييز بعضها عن بعض وفقا لآخر شطف لهم. الكسور يمكن جمعها إما يدويا أو باستخدام جامع جزء الآلي. (ب) Coomassie هلام من ثلاثة مكررات لتنقية هيستون.= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot; الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> الرقم 3: جعل من مسارح البقشيش التوصيل مع P1000 ماصة، لكمة قرص مصنوع من C 18 مادة من قرص استخراج المرحلة الصلبة (الفريق الثاني). سوف MiniDisk لعصا في طرف (لوحة المتوسطة)، بحيث يمكن دفع بها إلى ماصة P100 أصغر / 200 باستخدام أي نوع من الشعرية الصغيرة. في هذا المثال، استخدمنا 700 ميكرون قطرها الخارجي السيليكا تنصهر أنابيب. يجب دفع MiniDisk للأسفل ماصة P100 / 200 حتى أنه لا يمكن أن تذهب إلى أي مزيد من (لوحة الماضية). غيض المرحلة هو على استعداد لتحلية هيستون، كما أن لديها القدرة الكافية للاحتفاظ ما يكفي من المواد عينة للعديد من مكررات. على وجه التحديد، MiniDisk لواحدة تكفي ل15-20 ميكروغرام من ساmple. إذا كنت بحاجة إلى المزيد من العينة، والأقراص متعددة يمكن أن تكون معبأة على بعضها البعض. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> الرقم 4: التمثيل التخطيطي من السلاح وDIA طرق عند استخدام السلاح، وتتميز دورة المسح MS عن طريق الانتقاء متتابعة من أيونات تمهيدا لتجزئة MS / MS وفقا لكثافتها وولاية تهمة. مرة واحدة وقد تم تجزئة أيون السلائف يتم وضعها في قائمة استثناء لتجنب اختيار المتكررة من نفس الببتيد، بحيث MS يمكن &quot;حفر&quot; إلى إشارات أقل وفرة. هذه طريقة الشراء هو الأسلوب المفضل في البروتينات لوضع الاكتشاف. ويتحقق الكمي من خلال دمج إشارة مسح كامل لايون نظرا القادمة إلى MS تحديد /MS الطيف. في مطار دبي الدولي، تم تجزئة كامل نطاق م / ض في كل دورة المسح الضوئي. هذا النهج هو أقل ملاءمة لوضع الاكتشاف، ولكنها تنتج لمحة الكروماتوغرافي من كل الأيونات، السلائف والمنتجات. وهذا يؤدي إلى تقدير أكثر ثقة والتمييز من أشكال إسوي الضغط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> الرقم 5: الكمي لإسوي الضغط الببتيدات (أ) مثال اثنين من الببتيدات إسوي الضغط عادة وفيرة في تحليل هيستون. اللوني ايون المستخرج (XIC) من كتلة السلائف والنظائر النسبية (أعلاه) مطابق. ومع ذلك، فإن XIC من الأيونات المنتج (أدناه) يسمح للتمييز من هذين الشكلين إسوي الضغط. والجدير بالذكر، يجب أن يكون لنا الأيونات شظية الفريدة فقطإد لتقدير الوفرة النسبية للنوعين. (ب) تمثيل أيونات جزء فريدة من نوعها لاثنين من الببتيدات وصفت (باللون الأحمر). قائمة (ج) من الببتيدات تحليلها عادة في الإنسان العاقل وجود ما يعادل إسوي الضغط واحد على الأقل. تسلسل المتغيرات بين وأشار الببتيدات هيستون المدرجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> الشكل 6: ممثل النتائج من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع وبدون الريتينويك علاج حمض (A) الكمي النسبي من الببتيد هيستون H3 KQLATKAAR (أأ 18 - 26) في كل من proteoforms معدلة. وقدرت الوفرة النسبية باستخدام جميع proteoforms الى 100٪ (ويختلطلا يظهر نسبة ative من الببتيد معدلة) (B) الكمي النسبي للهيستون H3 الببتيد KSTGGKAPR (أأ 9 - 17) (C) وفرة نسبية من الببتيدات الكشف عن H3 هيستون الكنسي مع وبدون العلاج بالخلايا مع حمض الريتينويك. يشير هذا الرقم في أي من المعاملتين التعديلات المعطاة هي أكثر وفرة (&gt; 50٪). وعموما، علينا أن نبرهن على هيستون H3 أستلة انخفاض في معظم بقايا يسين على تحريض تمايز الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حل # </td><td colspan="7"> تركيب </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> يتم عزل النووي الواق الأوراق المالية (بنك الاستثمار القومي) على النحو التالي وتخزينها المجمدة الى 100 مل aliquots في -20 درجة مئوية. إذابةويمكن تخزين طرف مستدق عند 4 درجة مئوية لمدة أسابيع قليلة: 15 ملي تريس، 60 مم بوكل، 15 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2، 1 ملم CaCl 2، و 250 ملي السكروز. يتم ضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك. </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="7"> مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة إلى مخازن قبل الاستخدام): 1 M Dithiothreitol (DTT) في [ده 2 O (1،000x)؛ 200 ملي AEBSF في ده 2 O (400X) </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="7"> الفوسفاتيز المانع (إضافة جديدة إلى مخازن قبل الاستخدام): 2.5 ميكرومتر Microcystin في الإيثانول بنسبة 100٪ (500X) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> مثبط HDAC (إضافة جديدة إلى مخازن قبل استخدامها): 5 الزبدات M الصوديوم، الذي أدلى به معايرة حمض 5 M زبدي باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.0 (500X) </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="7"> NP-40 البديل: 10٪ ت / ت في [ده 2 O </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> 0.2 MH 2 SO 4 في ده 2 O </td></tr><tr><td> 7</td><td colspan="7"> حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA): 100٪ ث / ت في [ده 2 O </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> الأسيتون + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك): 0.1٪ حجم / حجم حمض الهيدروكلوريك في الأسيتون </td></tr></tbody></table> الجدول 1. حلول.

Watch this Scientific Journal Video about Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis at JoVE

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

ويعرض هذا البروتوكول على سير العمل متكامل للتميز هيستون التعديلات بعد متعدية باستخدام مطياف الكتلة (MS). يتضمن سير العمل تنقية هيستون من مزارع الخلايا أو الأنسجة، اشتقاق هيستون والهضم، وتحليل MS باستخدام النانو تدفق اللوني السائل وتعليمات لتحليل البيانات. تم تصميم بروتوكول لاستكمال غضون 2 - 3 أيام.

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

إثراء التقارب المتزامن لتعديلات ما بعد الترجمة للقياس الكمي وتوطين الموقع

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...