Name: complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממענקים NIH (DP2OD007447, R01GM110174 ו R01AI118891).

<ol>
	<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canalization+of+development+and+the+inheritance+of+acquired+characters.">Canalization of development and the inheritance of acquired characters.</a> Nature. 150, 563-565 (1942).</li><li>Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+cancer.">Epigenetics in cancer.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 27-36 (2010).</li><li>Reik, W., Dean, W., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+mammalian+development.">Epigenetic reprogramming in mammalian development.</a> Science. 293 (5532), 1089-1093 (2001).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Tessarz, P., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+core+modifications+regulating+nucleosome+structure+and+dynamics.">Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 703-708 (2014).</li><li>Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+and+chromatin+cross-talk.">Histone and chromatin cross-talk.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (2), 172-183 (2003).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+histone+crosstalk.">The language of histone crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Simboeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Phosphorylation+Switch+Regulates+the+Transcriptional+Activation+of+Cell+Cycle+Regulator+p21+by+Histone+Deacetylase+Inhibitors.">A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors.</a> J Biol Chem. 285 (52), 41062-41073 (2010).</li><li>Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+serine+10+phosphorylation+by+Aurora+B+causes+HP1+dissociation+from+heterochromatin.">Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin.</a> Nature. 438 (7071), 1176-1180 (2005).</li><li>Xhemalce, B., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromodomain+switch+mediated+by+histone+H3+Lys+4+acetylation+regulates+heterochromatin+assembly.">A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly.</a> Genes Dev. 24 (7), 647-652 (2010).</li><li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers.">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142 (6), 967-980 (2010).</li><li>van Attikum, H., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+histone+modifications+during+the+DNA+damage+response.">Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response.</a> Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+is+required+for+chromatin+remodeling+and+inactivation+of+sex+chromosomes+in+male+mouse+meiosis.">H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis.</a> Dev Cell. 4 (4), 497-508 (2003).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> Embo J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics:+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry.">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li><li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Shotgun+Quantitative+Mass+Spectrometry+Characterization+of+Histones.">One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li><li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawbacks+in+the+use+of+unconventional+hydrophobic+anhydrides+for+histone+derivatization+in+bottom-up+proteomics+PTM+analysis.">Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis.</a> Proteomics. 15 (9), 1459-1469 (2015).</li><li>Lin, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+histone+posttranslational+modification+patterns+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).</li><li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWATH+Analysis+for+Characterization+and+Quantification+of+Histone+Post-translational+Modifications.">SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications.</a> Mol Cell Proteomics. , (2015).</li><li>Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SAHA-Dependent+Changes+in+Histone+Modifications+Using+Data-Independent+Acquisition+Mass+Spectrometry.">Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. , (2015).</li><li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiProfile+Quantifies+Histone+Peptides+With+Modifications+by+Extracting+Retention+Time+and+Intensity+in+High-resolution+Mass+Spectra.">EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+proteomic+search+engines+for+the+analysis+of+histone+modifications.">Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications.</a> J Proteome Res. 13 (10), 4470-4478 (2014).</li><li>Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylated+histone+H3K56+interacts+with+Oct4+to+promote+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency.">Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11493-11498 (2013).</li><li>Vonholt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Histones.">Isolation and Characterization of Histones.</a> Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).</li><li>Zhang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+acetylation+and+methylation+sites+of+histone+H3+from+chicken+erythrocytes+by+high-accuracy+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time-of-flight,+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-postsource+decay,+and+nanoelectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 306 (2), 259-269 (2002).</li><li>Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Variants+and+Their+Post-Translational+Modifications+in+Primary+Human+Fat+Cells.">Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells.</a> Plos One. 6 (1), e15960 (2011).</li><li>Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+different+mass+spectroscopic+techniques+for+the+analysis+of+dynamic+changes+of+histone+modifications.">A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications.</a> Proteomics. 4 (5), 1382-1396 (2004).</li><li>Zhao, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Post-translational+Modifications+upon+Ischemia/Reperfusion-Induced+Retinal+Injury.">Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury.</a> J Proteome Res. 13 (4), 2175-2186 (2014).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope-labeled+histone+peptide+library+for+histone+post-translational+modification+and+variant+quantification+by+mass+spectrometry.">Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2450-2466 (2014).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם בהתחשב עלויות, זמן, וביצועים. תכשירים אחרים אפשריים, אך יש להם מגבלות, במיוחד במקרה של צימוד עם ניתוח MS. למשל, פרוטוקול מיצוי גבוהה מלח יכול לשמש כדי לטהר היסטונים 26 במקום ממטרים TCA (סעיף 3). פרוטוקול גבוהה מלח הוא עניין מתון, כפי שהוא אינו משתמש חומצה חזקה. זו שומרת PTMs חומצה-יציבה ומגדילה את התשואה של היסטונים חילוץ, כמו ממטרי TCA שיתוף משקעים רבים חלבונים מחייבי אחרים הכרומטין. עם זאת, מיצוי גבוהה מלח מוביל דגימות המכילות מלח מרוכז מדי עבור HPLC-MS / MS. בשנת הכנה חלופית, עיכול היסטון יכול להתבצע ללא propionylation (סעיף 6 - 8), למשל על ידי צמצום זמן דגירת טריפסין ויחס אנזים / מצע 27 או באמצעות argc כמו אנזים עיכול 28-30. עם זאת, derivatization עם אנהידריד propionic מומלץ, כפי שאניt מוביל לדור של פפטידים הידרופובי יותר, אשר נשמרים טובים יותר במהלך כרומטוגרפיה נוזלית. עבור derivatization הכימי, מגוון פטאליק חומצה אורגני הוערך ו לגופן נדון באופן מקיף 18. אף על פי כן, אנהידריד propionic הוכיח את הפשרה הטובה ביותר בין מוצרי צד יעילים, ממוזער הידרופוביות פפטיד משופרות. פוטנציאלית, אנהידריד propionic ניתן לרכוש בצורה שכותרתו isotopically; זה מאפשר ניתוח ריבוב בשל האפשרות של ערבוב דוגמאות רבות ולהפלות אותם ברמת MS מבוססת על המסות השונות הנחילו מההתוויה הכבדה. עם זאת, ניתוח זה מוביל מורכב גובר של chromatogram LC-MS ומפחית את כמות המדגם כי ניתן להזריק עבור כל תנאי יחיד. בהקשר זה, כמה היבטים קריטיים של הפרוטוקול צריכים להיות מודגשים. ראשי הפרקים שלהלן אמורים לשמש checklist למצוא טעויות ביצוע ההליך במקרה תוצאות שליליות מתקבלות. ראשית, לאחר ממטרי גרעינים הגלולים יש לשטוף היטב עם NIB ללא NP-40 אלטרנטיבי (סעיף 2.10) עד להסרה מוחלטת של חומרי הניקוי (מורגש על ידי חוסר הבועות במהלך ערבוב). אם לא יעשה זאת יפגע חילוץ היסטון עם חומצות. שנית, לאחר ממטרים היסטון עם TCA (סעיף 3.9) שוטף של הגלולה עם אצטון הוא קריטי. נוכחות של חומצה מרוכזת תפגע בשלב הבא אם propionylation ועיכול (סעיף 6.1) מתבצעים בחלקם ישירות. זה יהיה לא בעייתי חלוקה היסטון במקרה מתבצע (סעיף 5). שלישית, זה הכרחי כי תגובת propionylation מתבצעת במהירות (סעיף 6.3 - 6.7). לשם כך, יש להימנע משימוש באותו תמהיל propionylation (אנהידריד propionic + אצטוניטריל) במשך יותר מ 3 - 4 דגימות רצופות. בנוסף, pH הוא ההיבט החשוב ביותר של מערכת העיכול טריפסין (סעיף 7). אם לאסביב 8.0 (7.5 - 8.5) לעיכול יהיה יעיל. זה יכול לקרות, כמו המדגם יהיה עשיר בחומצת propionic בשלב זה. ניתן להוסיף NH 4 OH עד לשימוש בהן. כמו כן, לחוקרים מכירים זרימות עבודת פרוטאומיקה זה ירגיש נורמלי להפוך לחומצה המדגמת לסיים עיכול טריפסין. זה לא צריך להיעשות, כפי שהוא יסכן את התגובה הבאה, כלומר, propionylation של פפטיד N-טרמיני (סעיף 8.1). לבסוף, באותו גיליון, חשוב לזכור לניתוח נתונים כי פפטידים ללא שינוי הם לא באמת ללא שינוי; כל שאריות ליזין ו- N-Termini חינם תהיינה תפוסות על ידי propionylation (56.026 Da). לכן, ביצוע כרומטוגרפיה יון לחילוץ של המסה המתאימה באופן ייחודי על רצף הפפטיד יוביל ללא תוצאות. המגבלות של השיטה הן בעיקר קשורים לחוסר היכולת של גילוי PTMs קומבינטורית, בשל רצף הפפטידים הקצר, ואת ההטיות בהשגת abun נכוןריקוד של שינוי, בשל העובדה כי פפטידים בצורות שונות שונות עשויים ליינן עם יעילות שונה. הנושא הראשון ניתן לפתור על ידי שילוב טכניקה זו עם מטה-באמצע או גישה מלמעלה למטה (הנסקרת ב 16). סוג זה של ניתוח, גם אם מאתגר יותר מבחינה טכנית, הוא אידיאלי עבור לומדי תדרים-קיום של שינויים. יתר על כן, היא מאפשרת אפליה טובה יותר של וריאנטים היסטון, אשר לא ניתן להשיג תמיד עם מלמטה למעלה מאז פפטידים מסוימים יש את אותו רצף גרסאות היסטון שונים. הנושא השני, הקשורים יעילות יינון, ניתן לפתור באמצעות ספריה של פפטידים סינתטיים 31. גישה זו מבטיחה הערכה מדויקת יותר של השפע היחסי של PTMs היסטון. עם זאת, ברוב הניסויים, התוצאה הרצויה היא השינויים ביחס של שינויים נתונים בין תנאים מנותחים. במקרה זה, תיקון כזה אינו הכרחי, בשל העובדה כי יש כל הדגימות באותו BIAים. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של PTMs היסטון שיכולה להסתיים בתוך 3 ימים באמצעות nLC מצמידים טנדם MS. השוואות עם טכניקות אחרות מאשר MS, כלומר, באמצעות אסטרטגיות מבוססות נוגדנים כפי שפורט במבוא, אינם מתאימים, כמו שהם לא יכולים להשיג אפילו כמעט רמה זו של תפוקה. בנוסף, טכניקות המבוססים נוגדן לא תאפשרנה הגילוי של שינויי רומן, אבל הם מבוססים אך ורק על אישור וכימות סימני חזה. כך אנו משערים כי פרוטאומיקה מלמטה למעלה על פפטידים היסטון יהיה לצבור פופולריות במעבדות חקר חלבונים בשל היתרונות אינטואיטיבי לדעת הסדרת סימני היסטון, שהן גיבורים בביטוי גנים טיונינג ובכך להשפיע על הרגולציה של proteome. יתר על כן, פרוטוקול המתואר כולל השיפורים האחרונים בהכנת מדגם ותוכנות לניתוח נתונים, ההופכים ניתוח היסטון טריוויאלי יותר גם עבור laboraהטורים כי מעולם לא חוו אפיון של סוג זה של פפטידים hypermodified.

אפיגנטיקה מוגדרת בחקר שינויים תורשתיים בביטוי גנים המתעוררים על ידי מנגנונים אחרים מאשר לשנות את רצף ה- DNA הבסיסי 1. תקנה אפיגנטיים היא קריטית במהלך פיתוח כמו האורגניזם עובר פנוטיפי דרמטית משנה למרות תוכן DNA שלו לא משתנה. ישנם מספר מרכיבים קריטיים הדרושים לתחזוקה אפיגנטיים, ובכלל זה שינויים היסטון שלאחר translational (PTMs), גרסאות היסטון, RNAs ללא קידוד, מתילציה DNA וגורמים DNA מחייבת, שכל אחד מהם משפיעים על ביטוי גנים באמצעות מנגנונים שונים 2. לדוגמא, בעוד מתילציה DNA הוא שינוי מאוד יציב שמדכא תרגום גן 3, גרסות היסטון ו PTMs היסטון הם הרבה יותר דינמי יכול להשפיע הכרומטין במגוון דרכים 4. PTMs היסטון בעיקר הם נקודתיים על זנבות N-terminal, כפי שהם באזור החשוף ביותר וגמיששל החלבון. עם זאת, הליבה הנוקלאוזום גם היא שונה בכבדות לעומת חלבונים ממוצעים 5. למרות סימני היסטון מתאפיינים בהרחבה בעשור האחרון, קישורים רבים בין סימני היסטון ידועים ותפקודם עדיין אינם ברורים. זהו בעיקר בשל העובדה שרוב PTMs היסטון לא עובד לבד, אלא פונקציה בד בבד עם אחרים PTMs ( &quot;צולב לדבר&quot;) לשנות תהליך מסוים כגון שעתוק 6,7. למשל, H3S10K14ac סימן קומבינטורית על p21 הגן מפעיל שעתוק שלה, אשר לא יתרחש עם רק אחד משני PTMs 8. מחזק HP1 חלבון הכרומטין ידי הכרת H3K9me2 / ME3 והפצת ששינוי נוקלאוזום הסמוך. עם זאת, HP1 לא יכול להיקשר H3K9me2 / 3 כאשר S10 הסמוך עובר פוספורילציה 9. Acetylation של H3K4 מעכב המחייב של spChp1 חלבון H3K9me2 / ME3 ב שמר החלוקה 10. יתר על כן, ד ליזין היסטוןemethylase PHF8 יש את היעילות מחייב הנוקלאוזום הגבוהה ביותר כששלושה PTMs H3K4me3, K9ac, ו K14ac נוכחים 11. דוגמאות אלה מדגישים את החשיבות של השגת סקירה עולמית של שינויי PTM היסטון במקום להתמקד שינויים יחידים. הנוכחות של רצף וריאנטים גם מגדילה את המורכבות של ניתוח היסטון, כמו isotypes היסטון בדרך כלל יש רצפים דומים מאוד, אך לרוב יש תפקידים שונים הכרומטין. לדוגמה, H2A.x יש רצף מסוף-C אשר פוספורילציה יותר בקלות על נזק לדנ&quot;א לעומת H2A הקנונית 12, והוא נדרש עבור איון של כרומוזומי המין ב המיוזה עכבר זכר 13; באופן דומה, CENP-תחליפים H3 היסטון קנוני צנטרומר 14. למרות הפונקציות השונות שלהם, הגירסות אלה חולקים חלק גדול של רצף החומצות האמיניות שלהם עם היסטון הקנונית בהתאמה, מה שהופך אותו קשה לזהות ולכמת אותם בנפרד. </p&gt; נוגדן מבוסס טכניקות כגון מערבי סופג אומצו באופן נרחב כדי לאפיין היסטונים. עם זאת, גישות המבוססים על נוגדנים מוגבלות מהסיבות הבאות: (i) הם יכולים רק לאשר את קיומו של שינוי ולא יכולים לזהות PTMs הידוע; (Ii) הם מוטים בשל נוכחותם של סימנים קיימים שיתוף, אשר יכול להשפיע על זיקה מחייבת; (iii) הם לא יכולים לזהות סימני קומבינטורית, כפי שרק מעטים מאוד נוגדנים זמינים למטרה זו וכן (iv) הם צולבים להגיב בין וריאנטים היסטון דומים מאוד או PTMs הדומה (למשל, דוּ ו trimethylation של שאריות ליזין). Egelhofer et al. תאר כי יותר מ -25% של נוגדנים מסחריים להיכשל בדיקות סגוליות ידי כתם נקודה או כתם מערבי, ובקרב נוגדנים ספציפיים יותר מ -20% נכשלים בניסויי immunoprecipitation הכרומטין 15. ספקטרומטריית מסה (MS) היא כיום כלי אנליטי המתאים ביותר ללמוד PTMs הרומן ו / או קומבינטורית,וזה יושם בהרחבה עבור חלבונים היסטון (הנסקרת ב 16). זהו בעיקר בשל רגישות גבוהה ודיוק המוני של MS, והאפשרות לבצע בקנה מידה גדול מנתח. האסטרטגיה מלמטה למעלה היא אסטרטגית פרוטאומיקה MS המבוססת הנפוצה ביותר לאפיון היסטון ו PTMs שלהם, שבו החלבון השלם מתעכל enzymatically לתוך פפטידים קצרים (5 - 20 aa). אכול זו מאפשר לשני הפרדת LC וזיהוי MS. מיסות בטווח של 600 - 2,000 Da הן בדרך כלל יותר ש&#39;ליינן והזדהו עם דיוק מסה גבוה יותר ורזולוציה מ המונים גדולים. פיצול MS / MS הוא גם שפר, פפטידים קצרים הם בדרך כלל מתאימים היטב דיסוציאציה מושרה התנגשות (CID). עם זאת, היסטונים מציבים אתגר בפני MS מלמטה למעלה כפי שהם מועשרים ב שאריות חומצת אמינו בסיסיות, כלומר ליזין ארגינין. לכן, עיכול טריפסין מוביל לדור של פפטידים כי הם גם SMכל עבור החזקת LC ולוקליזציה חד משמעית של PTMs. כדי לעקוף בעיה זו, הפרוטוקול שלנו כולל כימי ליזין פפטיד N- המסוף derivatization 17. שימוש אנהידריד propionic מומלץ עבור derivatization הכימי היעיל לעומת חומרים כימיים אחרים 18. כזה בלוקים derivatization הקבוצות-אמינו ɛ של שאריות ליזין ללא שינוי ו monomethyl, המאפשר טריפסין לבצע proteolysis רק על C-terminal של שאריות ארגינין. אמיני derivatized לא יכולים להחליף פרוטונים עם הפתרון ובכך פפטידים באופן כללי בלבד כפליים או טעונים פי שלושה, הקלת MS ו- MS / MS זיהוי. יתר על כן, N-terminal derivatization מגביר הידרופוביות פפטיד ובכך שמירת chromatographic התהפך פאזי. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה כדי לטהר היסטונים ולהכינם ניתוח PTM דרך פרוטאומיקה מלמטה למעלה (איור 1). אסטרטגיה זו משיגה כימות של סימני היסטון יחידים וסימני קומבינטורית fאו PTMs היסטון כי הם קרובים יחסית של רצף החומצות האמיניות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">25200056</td>
			<td style="width:217px;">For harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Tris</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Calcium Chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">DTT</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">AEBSF</td>
			<td style="width:157px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:151px;">101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Microcystin</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M4194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sodium Butyrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">NP-40 Alternative</td>
			<td style="width:157px;">CALBIOCHEM</td>
			<td style="width:151px;">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sulfuric Acid, ACS grade</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Acetone</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:157px;">Biorad</td>
			<td style="width:151px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">30% acrylamide/bis 29:1 -- 500ml</td>
			<td style="width:157px;">Biorad</td>
			<td style="width:151px;">1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Coomassie</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm</td>
			<td style="width:157px;">Grace</td>
			<td style="width:151px;">218TP52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm</td>
			<td style="width:157px;">Grace</td>
			<td style="width:151px;">218TP54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:151px;">A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">TFA</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">propionic anhydride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">240311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">PRV5113</td>
			<td>For digesting histones for MS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">C18 extraction disk</td>
			<td style="width:157px;">Empore</td>
			<td style="width:151px;">2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:432px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis

נוקלאוזום הוא יחידת המבנה הקטנה ביותר של הכרומטין, מורכבת 147 זוגות בסיסים של DNA עטופים סביב octamer של חלבונים היסטון. פונקצית היסטון מתווכת על ידי שינוי שלאחר translational נרחב על ידי מספר עצום של חלבונים גרעיניים. שינויים אלה הם קריטיים עבור שלמות גרעינית כפי שהם מווסתים אנזימי מבנה ולגייס הכרומטין מעורב ויסות גנים, תיקון DNA ועיבוי כרומוזום. למרות חלק גדול של הקהילה המדעית מאמץ טכניקות מבוססות נוגדנים לאפיין שפע PTM היסטון, הגישות הללו הן תפוקה נמוכה ומוטה נגד חלבוני hypermodified, כמו epitope עלול להיות חסומים על ידי שינויים בסביבה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של כרומטוגרפיה נוזלית ננו (nLC) ו ספקטרומטריית מסה (MS) כימות מדויק של שינויים היסטון. שיטה זו נועדה לאפיין מגוון רחב של PTMs היסטון ואת השפע היחסי של היסטון כמה גרסאות בתוך יםingle מנתח. בפרוטוקול זה, ההיסטונים הם derivatized עם אנהידריד propionic ואחריו עיכול עם טריפסין לייצר פפטידים של 5 - 20 aa באורך. לאחר העיכול, N-Termini שנחשפו מחדש פפטידים היסטון הם derivatized לשפר השמירה chromatographic במהלך nLC-MS. שיטה זו מאפשרת כימות היחסית של PTMs היסטון פורש ארבעה סדרי גודל.

כדוגמה, ניתחנו ההיסטונים המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) עם ובלי חומצה רטינואית (RA) גירוי, החל עם 200 כדורי תא μl. נוכחות של RA תרבית תאים מוביל בידול ESC. מתוך התא גלול, על 50 - 100 מיקרוגרם של היסטונים חולצו, וזה יותר מאשר מספיק כדי לבצע זריקות LC-MS מרובים של פפטידים היסטון. לאחר derivatization, עיכול, desalting, דגימות הועמסו על עמודה 75 מיקרומטר x 15 ס&quot;מ C 18 (קוטר החלקיקים 3 מיקרומטר, גודל הנקבוביות 300 א) במצב סדרתי עם מערכת כרומטוגרפיה ננו נוזלי בעל ביצועים גבוהים עם שבבי microfluidic מצמידים quadrupole מלכודת ליניארי היברידית - ספקטרומטר מסה orbitrap. רכישת MS בוצעה באמצעות DIA. במקביל, דגימות נותחו גם עם שיטת DDA באמצעות UHPLC ננו-זרימה מצמיד את ספקטרומטר מסת מלכודת orbitrap יון היברידי (מידע לא מוצג). בכל מחזור, בוצע orbitrap האיתור מלא MS אחד עם טווח הסריקה של 290 עד 1,400 מ &#39;/ z, ברזולוציה של 60,000 (200 מ&#39; / z) AGC 10 6. לאחר מכן, במצב רכישת נתונים תלוי יושם עם דינמיקה הדרת 30 שניות. סריקות MS / MS היו במעקב על יוני הורה מאלה האינטנסיביים ביותר. יונים עם מדינה אחראית אחד לא נכללו MS / MS. חלון בידוד של 2 מ &#39;/ z היה בשימוש. יונים היו מקוטעים באמצעות דיסוציאציה מושרה התנגשות (CID) עם אנרגית התנגשות של 35%. זיהוי מלכודת יון שמש עם מצב טווח סריקה נורמלי קצב סריקה רגיל עם AGC 10 4. נתונים גולמיים MS נותחו אימוץ תוכנה להפקת chromatograms מבשר שבר יון, כלומר Skyline 23 ו EpiProfile 22. EpiProfile עבר אופטימיזציה עבור פפטידים היסטון, כפי שהוא משתלב החילוץ אזור השיא אינטליגנטי בשל הידע הקודם של עידודזמן שמירה גא. מצד שני, קו רקיע הוא מותאם במיוחד DIA מנתח, וכך הדמויות DIA מוצג (איורים 4 ו -5 א) הם צילומי מסך מתוכנה זו. מן הכרומתוגרמה יון חילוץ, את השטח מתחת לעקומה מאוחזר, וזה משמש כדי להעריך את השפע של כל פפטיד. שטח שיא chromatographic חושבה עבור [M + H] + [M + 2H] 2 +, ו [3H M +] 3+ יונים מאותו פפטיד, למרות שברוב המקרים [2H M +] 2+ הייתה הצורה השכיחה. זה מספק שפע הגלם של צורה שונה נתונה של פפטיד. על מנת להשיג את השפע היחסי של PTMs, סכום כל הצורות השונות השונות של פפטיד היסטון נחשב 100%, ואת השטח של הפפטיד בפרט מחולק ע&quot;י השטח הכולל לאותה פפטיד היסטון בכל צורותיה השונות שלה . פפטידים היסטון נוכחים בתוך va<html> riety של צורות isobaric (איור 5). פפטידים Isobaric, למשל, K18ac ו K23ac, ניתן לכמת רק ברמת MS / MS, שבו היונים שהברים הייחודיים שלהם משמשים כדי לקבוע את היחס בין מיני isobaric (איור 5 א ו 5 ב). יחס זה משמש לחלק את השטח של שיא chromatographic בין שני המינים. בעת שימוש DDA, צורות isobaric אלה נכללו ברשימת המונים ממוקדים, כי הפפטידים האלה צריכים להיבחר פיצול דרך elution כולו שלהם, אשר לא יתרחש ניסוי DDA סטנדרטי. האפליה של השפע היחסי של מינים isobaric מכן מבוצעת על ידי ניטור פרופיל elution של יונים שבר. סוג של רכישה מצד שני, DIA אינו דורש שום מרשימת כלילה. עם זאת, זה סוג של שיטת רכישה אינו עולה בקנה אחד עם חיפוש מסד נתונים מסורתי, ולכן עשוי למנוע גילוי פפטידים שונה ידוע. התחת = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; acetylation ליזין (+ 42.011 Da) היה מופלים מן trimethylation כמעט isobaric (+ 42.047 Da) באמצעות ברזולוציה גבוהה רכישת MS (&gt; 30,000). יתר על כן, acetylation יותר הידרופובי מ trimethylation, שמוביל elution של פפטידים acetylated יאוחר אלה trimethylated בהתאמה. הצורה ללא שינוי מאותו פפטיד elutes אפילו מאוחר יותר, בשל העובדה כי ליזין הוא propionylated. לסיכום, בסדר גודל של הידרופוביות עבור פפטיד עם האתר לשינוי אחד הוא דוּ ו trimethylated &lt;acetylated &lt;ללא שינוי (propionylated) &lt;monomethylated (propionylated). hESCs הראה ירידה ברורה של פפטידים acetylated כאשר מגורה לבידול (איור 6 א ו 6 ב). הדבר לא היה מפתיע, כמו תוצאות קודמות דיווחו acetylation גבוהה ESCs לעומת אלה המבדילים 25,המשקף את האופי המתירני בדרך של הכרומטין פלוריפוטנטיים. על ידי התמקדות H3 היסטון, 35 צורות שונות שונות כומתו (איור 6 ג). עם זאת, כל proteoforms היסטון שניתן לחקור עם גישה זו יותר מ -200, כולל כל הגרסאות היסטון ושינויים שפע נמוך (מידע לא מוצג). יתר על כן, הניתוח שלנו הראה כי שחזור גבוה ניתן להשיג בין משכפל הטכני, כפי שמעיד גדליו הקטנים של ברי השגיאה (מייצג ± סטיית תקן). יחדיו, סעיף זה מתאר כיצד לחלץ את השפע היחסי של פפטידים שונה היסטון באמצעות נתונים nLC-MS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> איור 1:. Workflow עבור ניתוח מלמטה למעלה MS / MS היסטון עשרת השלבים לניתוח היסטון נראים לעין, כולל הערכה של הזמן הנדרש לכל שלב.<html> מספר הסעיף ניתן בסוגריים כמו הווה בכתב היד. סעיף 5, מתאר חלוקת מדגם לבודד את גרסות היסטון השונות, ניתן להשמיט, אלא אם יש צורך בניתוח רגישות הגבוהה של גרסה נתונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> איור 2: הפוך-השלב הגבוה זרימת LC עבור היסטון Variant חלוק ו Coomassie ג&#39;ל (א) chromatogram LC-UV מייצג הפרדה היסטון ללא פגע.. וריאנטים היסטון H3 יכול להיות מופלים זה מזה בהתאם לזמן elution שלהם. שברים ניתן לאסוף באופן ידני או באמצעות אספן חלק אוטומטי. (ב) Coomassie ג&#39;ל של שלושה משכפל של טיהור היסטון.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> איור 3:. ביצוע של שלב-tipping תקע עם קצה פיפטה P1000, אגרוף בלוח עגול עשוי C 18 חומר מדיסק מיצוי שלב מוצק (הפאנל השני). Minidisk שייחקק הקצה (הפנל באמצע), כך שהוא יכול להיות דוחף החוצה אל קצה פיפטה P100 הקטן / 200 באמצעות כל סוג של נימים קטנות. בדוגמא זו, השתמשנו צינורות סיליקה התמזגה קוטר חיצוני 700 מיקרומטר. Minidisk צריך להידחף לתחתית של קצה פיפטה P100 / 200, עד שלא תוכל ללכת יותר (הפאנל האחרון). הטיפ הבמה מוכן desalting היסטון, שכן יש קיבולת מספקת כדי לשמור על חומר מדגם מספיק משכפל רב. באופן ספציפי, minidisk אחת מספיקה עבור 15 - 20 מיקרוגרם של sample. אם יותר מדגם נדרש, מספר דיסקים יכול להיות ארוזים על אחד אחר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> איור 4:. ייצוג סכמטי של שיטות DDA ו DIA בעת שימוש DDA, מחזור סריקת MS מאופיין מבחר רציפים של יונים מבשרים על פיצול MS / MS פי ועוצמתם ומדינת תשלום. פעם יון מבשר כבר מקוטע זה מושם לתוך רשימת הוצאה מן הכלל, כדי למנוע בחירה חוזרת ונשנית של אותו פפטיד, כך MS יכול &quot;לחפור&quot; לאותות פחות בשפע. שיטת הרכישה זוהי טכניקה של בחירה פרוטאומיקה עבור למצב גילוי. כימות מושגת על ידי שילוב אות הסריקה המלאה של יון נתון ליד MS המזוהית /ספקטרום MS. ב DIA, טווח m / z כולו מקוטע בכל מחזור סריקה. גישה זו היא פחות מתאימה למצב גילוי, אבל זה מייצר פרופיל chromatographic של כל היונים, מבשרים ומוצרים. זה מוביל בטוח יותר כימות ואפליה של צורות isobaric. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> איור 5: כימות פפטידים Isobaric (א) דוגמה של שני פפטידים isobaric נפוץ בשפע ניתוח היסטון.. הכרומתוגרמה יון החילוץ (XIC) מסת מקדימם איזוטופים יחסית (מעל) זהה. עם זאת, XIC של יוני המוצר (להלן) מאפשר אפליה של שתי צורות isobaric. יש לציין, יונים ייחודיים שבר רק צריכים להיות לנוed להעריך את השפע היחסי של שני המינים. (ב) ייצוג של יונים שברים הייחודיים עבור שני פפטידים תארו (המסומן באדום). (ג) רשימה של פפטידים נתחו נפוץ ההומו ספיינס שיש לפחות שווה ערך isobaric אחד. רצף גרסאות בין פפטידים היסטון המפורטים מסומנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> איור 6: תוצאות נציג של בתאי גזע עובריים אנושיים עם ובלי החומצה הרטינואית הטיפול (א) כימות יחסית של הפפטיד H3 היסטון KQLATKAAR (אא 18 - 26) בכל proteoforms שונה שלה.. השפע היחסי נאמד באמצעות כל proteoforms כמו 100% (את relאחוז ative של הפפטיד ללא שינוי אינו מוצג) (B) כימות יחסית של הפפטיד H3 היסטון KSTGGKAPR (אא 9 -.. 17) (ג) השפע היחסי של פפטידים זוהה עבור H3 היסטון הקנונית עם ובלי טיפול בתאי עם החומצה הרטינואית. הנתון מציין באיזה משני טיפולי השינויים הנתונים הם עשירים יותר (&gt; 50%). בסך הכל, אנו מראים כי acetylation היסטון H3 יורד ברוב של השאריות ליזין על אינדוקציה של התמיינות תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון # </td><td colspan="7"> הרכב </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> מאגר בידוד גרעיני (NIB) המניות נעשית כדלקמן ומאוחסנים קפוא כמו aliquots 100 מ&quot;ל ב -20 ° C; מופשרNIB יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות: 15 מ&quot;מ טריס, 60 KCl מ&quot;מ, 15 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ 2 MgCl, 1 מ&quot;מ CaCl 2, ו -250 סוכרוז מ&quot;מ. ה- pH של המאגר מותאם 7.5 עם HCl. </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="7"> מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי מאגרים לפני השימוש): 1 M Dithiothreitol (DTT) ב DDH 2 O (1,000x); 200 מ&quot;מ AEBSF DDH 2 O (400x) </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="7"> מעכב phosphatase (להוסיף טרי מאגרים לפני השימוש): 2.5 מיקרומטר Microcystin ב 100% אתנול (500x) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> מעכב HDAC (להוסיף טרי מאגרים לפני השימוש): 5 M בוטיראט נתרן, שנעשו על ידי טיטרציה של חומצה 5 M בוטירית באמצעות NaOH ל -7.0 pH (500x) </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="7"> NP-40 האלטרנטיבי: / v 10% נ ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> 0.2 MH 2 SO 4 ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> 7</td><td colspan="7"> חומצה Trichloroacetic (TCA): 100% w / v ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> אצטון + 0.1% חומצה הידרוכלורית (HCl): 0.1% v / v HCl אצטון </td></tr></tbody></table> לוח 1. פתרונות.

Watch this Scientific Journal Video about Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis at JoVE

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...