Name: genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

इस काम के जेनेटिक्स, विकास और सेल बायोलॉजी और आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के विभाग द्वारा और एनआईएच अनुदान EY024941 (WJ) .Dr द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेफरी Essner पांडुलिपि पर टिप्पणियों प्रदान की है।

सभी पशु प्रक्रियाओं के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार में थे और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी में और मैरीलैंड विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदि...

उल्लेखनीय प्रगति लक्षण के विकास के आनुवंशिक आधार को समझने की दिशा में हाल के वर्षों में किया गया है। लक्षण के एक नंबर के विकास अंतर्निहित उम्मीदवार जीन की पहचान की गई है, यह सबसे दिलचस्प evolutionarily प्रजाति क...

विशेषता विकास के आनुवंशिक आधार को समझने विकासवादी जीव का एक महत्वपूर्ण अनुसंधान लक्ष्य है। काफी प्रगति लक्षण के विकास अंतर्निहित लोकी की पहचान करने और इन लोकी (उदाहरण के लिए 1-3) के भीतर उम्मीदवार जीन pinpointing में किया गया है। हालांकि, कार्यात्मक परीक्षण के इन जीनों की भूमिका के रूप में कई लक्षण के विकास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल जीवों को चुनौती देने वाली बनी हुई है वर्तमान में आनुवंशिक रूप से विनयशील नहीं हैं। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के आगमन बहुत जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के आनुवंशिक manipulability बढ़ गया है। ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPRs) जीवों (उदाहरण के लिए 4-11) की संख्या में जीन में म्यूटेशन लक्षित उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये उपकरण, एक evolutionarily प्रासंगिक प्रणाली को लागू किया है, जिस तरह विकासवादी जीव विकास के आनुवंशिक आधार अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव की क्षमता है। Astyanax mexicanus मछली की एक प्रजाति है कि दो रूपों में मौजूद है। एक नदी में रहने वाली सतह फार्म (सतह मछली) और कई गुफा में रहने वाली रूपों (cavefish) ए mexicanus cavefish सतह मछली पूर्वजों (12 में समीक्षा) से विकसित हुआ। Cavefish की आबादी आंखों की हानि सहित, कमी या रंजकता के नुकसान के लक्षण की एक संख्या विकसित किया है, वृद्धि हुई स्वाद और कपाल neuromasts, और परिवर्तन की संख्या में इस तरह के स्कूली शिक्षा के व्यवहार की हानि, बढ़ आक्रामकता, आसन और hyperphagia 13 खिलाने में परिवर्तन के रूप में व्यवहार में -19। Cavefish और सतह मछली interfertile हैं, और आनुवंशिक मानचित्रण प्रयोगों गुफा लक्षण 1,20-26 के लिए लोकी और उम्मीदवार जीनों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। कुछ उम्मीदवार जीन अन्य प्रजातियों के 21 मॉडल जीवों में या overexpression 27 या क्षणिक पछाड़ना यू द्वारा सेल संस्कृति 1,19 में गुफा लक्षण में योगदान करने में एक कार्यात्मक भूमिका के लिए परीक्षण किया गया है,ए में morpholinos 28 गाना mexicanus। हालांकि, इन तरीकों में से प्रत्येक सीमाएँ हैं। ए में इन जीनों की उत्परिवर्ती alleles उत्पन्न करने की क्षमता mexicanus cavefish के विकास में उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, ए mexicanus जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के आवेदन के लिए एक आदर्श उम्मीदवार जीव है। यहाँ हम ए में जीनोम संपादन के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार mexicanus TALENS का उपयोग कर। इस विधि phenotypes के लिए और ब्याज 29 के जीन में म्यूटेशन स्थिर साथ मछली की तर्ज अलग-थलग करने के लिए पच्चीकारी इंजेक्शन संस्थापक मछली का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection station</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle puller</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">Kit #1000000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Teknova TET-15 in 50% EtOH</td>
			<td style="width:71px;">Teknova (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-843-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2957-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Super Ampicillin (1000x solution)</td>
			<td style="width:71px;">DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6060-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERR0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1620-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">BsaI</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-812-203</td>
			<td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">provided with restriction enzymes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10x T4 ligase buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-C1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">GoTaq Green Master mix</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PRM7123</td>
			<td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Quick ligation kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-811-728</td>
			<td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C4040-06</td>
			<td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Esp 3I</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERER0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td>
			<td style="width:71px;">Epicentre (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">NC9046399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td>
			<td style="width:71px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-3119-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sac I</td>
			<td style="width:71px;">Promega (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-R6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1348M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Ambion (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eliminase</td>
			<td style="width:71px;">Decon (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">04-355-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microcaps</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN जोड़ी इंजेक्शन विशिष्ट डीएनए न्यूक्लियोटाइड को RVDS की FokI डोमेन की dimerization बाध्यकारी है और इस तरह के परिणाम, डबल असहाय टूटता 39 जो शामिल होने (NHEJ) गैर मुताबिक़ अंत के माध्यम से ठीक किया जा ?...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

जीन को लक्षित mutagenesis के जीनोम संपादन तकनीक का उपयोग कर जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में अब संभव है। यहाँ, हम Astyanax mexicanus, मछली की एक प्रजाति है कि सतह मछली और cavefish भी शामिल है में प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) की तरह प्रतिलेखन उत्प्रेरक का उपयोग कर लक्षित जीन mutagenesis के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है।

में जीनोम एडिटिंग<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; का प्रयोग ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

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Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

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MiRNA मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग लक्ष्य के लिए जीनोम चौड़ा स्क्रीन

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

साथ जीनोम संपादन CompoZr कस्टम जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Chromatin Chromatin सहभागिता मानचित्रण और प्रतिलेखन विनियमन समझना के लिए बनती अंत टैग अनुक्रमण (Chia पीईटी) के साथ इंटरेक्शन विश्लेषण

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Danio rerio उपयोग कर रुग्ण ह्यूमन जीनोम की विवो मॉडलिंग में

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

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Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

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It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

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Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...