Name: genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

Эта работа финансировалась Департаментом генетики, развития и клеточной биологии и Университета штата Айова и грант NIH EY024941 (WJ) .DR. Джеффри Essner представили свои замечания по рукописи.

Все процедуры на животных были в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здоровья и были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете штата Айова и Университете штата Мэриленд по. 1. Talen Design <ol><li> Входной желаемый це?...

Большие успехи были достигнуты в последние годы на пути к пониманию генетической основы эволюции признаков. В то время как гены - кандидаты , лежащие в основе эволюции ряда признаков были идентифицированы, он остается сложной задачей , чтобы проверить эти гены в естественных условиях...

Понимание генетической основы эволюции признака является критической целью исследования эволюционных биологов. Значительный прогресс был достигнут в выявлении локусы , лежащие в основе эволюции признаков и точного определения генов - кандидатов в этих локусов (например 1-3). Тем не менее, функционально тестирование роль этих генов оставалась сложной, как многие организмы, используемые для изучения эволюции признаков в настоящее время не генетически сговорчивым. Появление редактирования генома технологий значительно повышенной генетической манипулируемости широкого спектра организмов. Активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPRs) использовались для генерации целевых мутации в генах , в ряде организмов (например , 4-11). Эти инструменты, применяемые к эволюционно соответствующей системы, имеют потенциал, чтобы революционизировать способ эволюционные биологи изучения генетической основы эволюции, Astyanax mexicanus является одним из видов рыб , которые существует в двух формах:. Река обитающие формы поверхности (поверхностная рыба) и несколько пещерных форм (cavefish) А. mexicanus cavefish эволюционировали от поверхности рыбы предков (обзор в 12). Популяции cavefish развили ряд признаков , включая потерю глаз, снижение или потеря пигментации, увеличение числа вкусовых почек и черепно - мозговых невромастами, а также изменения в поведении , такие как потеря стайного поведения, повышенной агрессивности, изменения в кормлении позы и гиперфагию 13 -19. Cavefish и поверхность рыбы скрещиваться, и генетические эксперименты картирования были проведены для выявления локусов и генов - кандидатов для пещерных признаков 1,20-26. Некоторые гены - кандидаты были проверены на функциональную роль в содействии пещерных черты в культуре клеток 1,19, в модельных организмах других видов 21 или сверхэкспрессией 27 или транзиторной нокдаун ˙Uпеть Morpholinos 28 в А. mexicanus. Тем не менее, каждый из этих методов имеет свои ограничения. Способность генерировать мутантные аллели этих генов в A. mexicanus имеет решающее значение для понимания их функции в эволюции cavefish. Таким образом, А. mexicanus является идеальным кандидатом для применения организм редактирования генома технологий. Здесь мы опишем метод для редактирования генома в A. mexicanus использованием Таленс. Этот метод может быть использован для оценки мозаики впрыскивается основателя рыбы для фенотипов и выделения линий рыбы со стабильными мутациями в генах , представляющих интерес 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection station</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle puller</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">Kit #1000000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Teknova TET-15 in 50% EtOH</td>
			<td style="width:71px;">Teknova (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-843-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2957-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Super Ampicillin (1000x solution)</td>
			<td style="width:71px;">DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6060-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERR0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1620-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">BsaI</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-812-203</td>
			<td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">provided with restriction enzymes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10x T4 ligase buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-C1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">GoTaq Green Master mix</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PRM7123</td>
			<td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Quick ligation kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-811-728</td>
			<td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C4040-06</td>
			<td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Esp 3I</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERER0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td>
			<td style="width:71px;">Epicentre (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">NC9046399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td>
			<td style="width:71px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-3119-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sac I</td>
			<td style="width:71px;">Promega (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-R6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1348M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Ambion (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eliminase</td>
			<td style="width:71px;">Decon (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">04-355-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microcaps</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Инъекции пара Talen приводит к связыванию RVDS до конкретных нуклеотидов ДНК и , таким образом димеризации доменов Foki, что приводит к двухцепочечных разрывов 39 , которые могут быть устранены через негомологичной конец присоединения (NHEJ). NHEJ часто вносит ошибки, к...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs (Video) | JoVE

Ген-таргетинга мутагенез теперь можно в широком диапазоне организмов с использованием методов редактирования генома. Здесь мы демонстрируем протокол для целевого гена мутагенеза с использованием активатора транскрипции как эффекторных нуклеаз (Таленс) в Astyanax mexicanus, вид рыбы , которая включает в себя поверхности рыбы и cavefish.

Геном Редактирование в<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Использование Транскрипция Активатор-как эффектор Нуклеазы (Таленс)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH (Video) | JoVE

Изображениями создания эффектов памяти Т-клеток в ухо после индукции приемных DTH

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio (Video) | JoVE

Гросс и изобразительных Препарирование Внутреннее ухо Сенсорные эпителия у взрослых данио рерио ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay (Video) | JoVE

Обнаружение сигнализации эффектор-Комплексы Вниз по течению от BMP4 Использование На месте НОАК, Пробирной Расстояние Лигирование

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library (Video) | JoVE

Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs (Video) | JoVE

Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation (Video) | JoVE

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio (Video) | JoVE

In Vivo Моделирование Morbid геноме человека Данио рерио использованием

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases (Video) | JoVE

Мышь Геном Инжиниринг Использование конструктора нуклеаз

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Функциональные изображений вирусных транскрипции заводов с использованием 3D флуоресцентной микроскопии

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus (Video) | JoVE

Коллекция гамет и экстракорпоральное оплодотворение Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...