Name: establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).

Merk: Prosedyrer for kloning og transformasjon av den rensede c-di-GMP reporter plasmid er omtalt andre steder 12. 1. Generering av GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain <ol><li> Inokulere 5 ml lysogeni buljong (LB) medium med en enkelt koloni av P. aeruginosa og inkuber over natten ved 37 ° C med risting ved 200 rpm. </li><li> Overføring 2 ml av over natten-kulturen i 200 ml frisk LB-medium i en 1-liters kolbe og inkubert ved 37 ° C med risting ved 200 rpm. </li><li> Overvåke optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) hver 30 minutter ved å ta en 1 ml prøve fra kolben og undersøke ved hjelp av et spektrofotometer (som beskrevet tidligere 12). </li><li> Når OD 600 griper mellom 0,3 til 0,5, plassere 40 ml av kulturen til et 50 ml konisk sentrifugerør. </li><li> Pellet cellene ved sentrifugering ved 8000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, supernatanten kastes og re-suspendere cellene i 40 ml is-kald, steril, 300 mM sukrose-løsning. </li><li> Pellet cellene en gang ved sentrifugering som beskrevet i trinn 1.5 og re-suspen i 20 ml is-kald, steril, 300 mM sukrose-løsning. </li><li> Pellet cellene en endelig tid ved sentrifugering som beskrevet i trinn 1.5 og re-suspen i 400 mL iskaldt, sterilt, 300 mM sukrose-løsning. Merk: celletetthet på dette punktet bør være ca. 1 x 10 11 kolonidannende enheter per milliliter (CFU / ml). </li><li> Chill cellene på is i 30 min, hvoretter de er klare for elektroporering. </li><li> Tilsett 1 pl av en 0,2 ug / ul pCdrA :: GFP C plasmid 12 oppløsning til 40 ul P. aeruginosa elektro-kompetente celler fremstilt ovenfor i et 1,5 ml mikrosentrifugerør som har vært på forhånd avkjølt på is. Bland suspensjonen og overfør til en på forhånd avkjølt, 2 mm elektrodegapet, elektroporering kyvette. Merk: pCdrA :: GFP </em&gt; C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, noe som gir et fluorescerende avlesning av det intracellulære nivået av c-di-GMP i P. aeruginosa stammer, ble utviklet og validert av Rybtke et al. 12. </li><li> Fjerne fuktighet på utsiden av kyvetten med silkepapir og plassere kuvetten inn i prøvekammeret i electroporator. Puls med en spenning på 2,5 kV, kapasitans på 25 uF og motstand på 200 Ω. </li><li> Fjern kyvetten og tilsett 1 ml LB-medium. Deretter overføre cellene til en steril 1,5 ml mikrosentrifugerør og inkuber i 2 timer ved 37 ° C med risting ved 200 rpm. </li><li> Spre 10 pl, 50 pl og 100 pl aliquoter av kulturen ut mot sterilt LB-agarplater supplert med ampicillin (ved en konsentrasjon på 100 ug / ml) og inkuber platene ved 37 ° C over natten. </li><li> Bekreft GFP uttrykk (excitatipå ved 485 nm, utslipps ved 520 nm) ved å undersøke platen under et fluorescens mikroskop med en standard GFP kanal og plukke en enkelt koloni å vaksinere 5 ml LB. Inkuber over natten som beskrevet i trinn 1.1. Bland 0,5 ml av natten kultur med 0,5 ml 50% glycerol i en 2 ml skrukork rør og oppbevar ved -80 ° C. </li></ol> 2. Utarbeidelse av Starter Kultur for Inoculation <ol><li> To dager før skjermen, plate P. aeruginosa-stamme (inneholdende pCdrA :: GFP C plasmid) fra -80 ° C lager på en LB-agarplate (supplementert med ampicillin i en konsentrasjon på 100 ug / ml) ved forsiktig spre bakterier over platen ved bruk av en steril inokulering loop. Platen inkuberes over natten ved 37 ° C. </li><li> Kvelden før screening, vaksinere en enkelt koloni av P. aeruginosa fra platen inn i 10 ml LB-medium (supplert med ampicillin ved en konsentrasjon på 100 ug / ml) i en tuvære og inkuber pre-kulturen over natten ved 37 ° C med risting ved 200 rpm. </li><li> På dagen for skjermen, forberede en subkultur fra den natten over pre-kulturen ved å fortynne den først med frisk LB-medium til en OD 600 på 1,0 og deretter ytterligere fortynning med 5% LB til en OD 600 på 0,04 (01:25 forhold) . Merk: Det totale volumet av det inokulerte medium er avhengig av antall plater som skal testes. 5% LB er fremstilt ved å fortynne 100% LB med fosfatbufret saltvann (PBS) til den ønskede konsentrasjon. Viktigere, media (5% LB) tillater konstitutiv aktivering av pCdrA :: GFP C i P. aeruginosa. </li><li> Legg til en steril magnetisk rørestav inn i beholderen og omrør kulturen ved minimal hastighet på en magnetisk rører i 30 minutter ved romtemperatur, slik at bakteriene for å akklimatisere seg til mediet før de blir dispensert inn i 384-brønns plater. </li></ol> 3. Inokulering og Inkubering av de 384-brønners plater inneholdendesmå molekyler Merk: Sterilitet og gode aseptiske teknikker er viktig å følgende trinn. <ol><li> For å fremstille den positive kontroll (100% inhibering), tilsett 20 ul tobramycin sulfat (25 mg / ml) til 10 ml (tilstrekkelig for opp til 12 plater) av subkulturen fremstilt i trinn 2.3 og bland forsiktig. Pipetter 40 ul av den positive kontrollkulturen i brønner A23 - P23 (figur 2). </li><li> For å forberede den negative kontrollen (0% hemming), tilsett 30 mL dimetylsulfoksid (DMSO) til 10 ml (tilstrekkelig for opp til 12 plater) av subkulturen forberedt i trinn 2,3 og bland forsiktig. Pipetter 40 ul av den negative kontrollkulturen i brønner A24 - P24 (figur 2). </li><li> For hver av platene stemplet med små molekyler, inokulere et volum på 40 ul av de fortynnede over natten kulturer (som er beskrevet i trinn 2,3) i brønnene A1 - P22 (figur 2). Merk: Dette kan oppnås ved hjelp av en flytende handler raneot. På grunn av de heterogene egenskapene til bakteriekulturer, er det viktig å opprettholde en kontinuerlig og moderat omrøring for å holde bakterier gående fordelt i mediet mens dispensering. For å gjøre dette, holde røring akklimatisert kultur fra trinn 2.4 magnetisk under utlevering. </li><li> Forsegle platene med en luft-gjennomtrengelig deksel tetning og inkuberes i 6 timer ved 37 ° C. Merk: luft-gjennomtrengelige tetning er kritisk for å opprettholde uforanderlige forhold over alle 384 brønner og for å omgå potensiale utvikling av oksygen gradienter tvers over platen. </li></ol> 4. Måling av vekst (OD 600) og Intracellulær c-di-GMP nivå (GFP) <ol><li> Ca 30 minutter før spektrofotometrisk måling, pre-varme platen leseren til 37 ° C for å unngå kondens. </li><li> fjerne luft-gjennomtrengelig dekselpakning forsiktig før du leser. Måle den optiske tetthet ved en bølgelengde på 600 nm med en innstilling på 10 blink pr brønn ogen innsovningstid på 0,2 sek. </li><li> Før måle fluorescens, lage en automatisk gevinst og fokusjustering basert på godt A24 (negativ kontroll) og sette forsterkningen målet verdi på 75% (figur 2). <ol><li> Fra plateavles kontroll programvare, kan du klikke på start måling og klikk på &#39;&#39; Focus og Gain Adjustment / Plate-IDer &#39;&#39; kategorien. </li><li> Velg &#39;&#39; Fokusjustering &#39;&#39; og &#39;&#39; Kanal A &#39;&#39; til høyre i vinduet. </li><li> Velg &#39;&#39; Gain Adjustment &#39;&#39; og &#39;&#39; Valgt godt &#39;&#39;, og skriv inn &#39;&#39; 75 &#39;&#39; som &#39;&#39; Target verdi &#39;&#39;. Endelig, plukke godt A24 i platen layout før du klikker på &#39;&#39; Begynn Justering &#39;&#39;. Når justeringen er utført, klikk på &#39;&#39; Start målingen &#39;&#39;. </li><li> Mål fluorescens fra GFP reporter på en eksitasjon / emisjon maxima av 485/520 nm med en innstilling på 10 blink per brønn og en settling tid på 0,2 sekunder. </li></ol></li><li> Samle inn data fra alle platene undersøkt. Merk: Data målingene lagres automatisk som standard ved plateleser kontroll programvare. <ol><li> Se opplesninger ved å klikke på &quot;Mars&quot; -ikonet innenfor kontroll programvare for å åpne den statistiske analysen pakke. </li><li> Hente data ved &quot;dobbeltklikke&quot; på plate nummer av interesse å få tilgang til data for analyse. </li></ol></li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Vurdere ensartethet og reproduserbarhet av analysen bruker robust z &#39;analyse, som er den vanligste kvalitet beregninger rapportert for high-throughput skjermer. Beregn robust z &#39;ved hjelp av formelen: <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> Hvor MAD (median-absoluttavvik) er et estimat av standardavviket, p er positiv kontroll (100% hemming), og n er den negative kontroll (0% inhibering) for både OD 600 og GFP values. Merk: En analyse med en robust z &#39;verdi (beregnet for både OD 600 og GFP rådata) som er større enn eller lik 0,5 er ansett som en utmerket analyse. </li><li> Beregn% inhibering av vekst ved hjelp av formelen: <img alt="ligning 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> Hvor Xi OD600 er den itererte OD 600 verdien for hver prøve godt. % Inhibering OD600&gt; 0, vekst-inhibitor; % Hemming OD600 &lt;0, vekst promoter. </li><li> Vurdere% inhibering av det intracellulære nivået av c-di-GMP ved hjelp av formelen (endringen i vilkårlig fluorescensintensitet enheter er korrigert for endringen i celletetthet): <img alt="ligning 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="ligning 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> Hvor Xi GFP er den itererte GFP verdien av hver prøve godt. % Inhibering GFP&gt; 0, c-di-GMP-inhibitor; % &amp;# 160; Inhibering GFP &lt;0, c-di-GMP-promoteren. </li><li> Sett en terskel for hit deteksjon ved tre MAD fra median (median ± 3 MAD), beregnet fra prøven belest-outs av hver plate, forutsatt en normal fordeling av datapunkter. Merk: Likevel kan en ± 50% hemming cut-off velges for mer reproduserbare og nøyaktige dose respons analyser om nødvendig. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recover+the+lost+art+of+drug+discovery.">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li><li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling:+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation?.">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?.</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li><li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+the+PilZ+don't+work:+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria.">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li><li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP:+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger.">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li><li> Boyd, C. D., GA, O. '. T. o. o. l. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation:+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems.">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li><li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa.">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li><li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria.">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation.">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development.">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li><li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

For å forbedre behandlingen av bakterieinfeksjoner, er det klart at en bedre forståelse av bakteriell oppførsel på molekylært reguleringsnivå er nødvendig. Prosedyren er beskrevet her vil være gunstig for mikrobiologer, biokjemikere og klinikere som ønsker å avdekke små molekyler som har potensial til å manipulere eller forstyrre cellulære konsentrasjoner av c-di-GMP i bakterier. Fremgangsmåten benytter et nylig utviklet GFP bioreporter å overvåke cellulære nivåer av c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Dette bioreporter har blitt validert og vist viktig ikke å påvirke veksten av stammen som brukes når dyrket i 5% LB i PBS. Bruken av en hel-celle-skjermen for å identifisere små molekyler som endrer c-di-GMP-nivåer in vivo overvinner de største vanskelighetene med target-baserte stoffet funnet i form av molekylet gjennomtrengning gjennom de bakterielle membraner, særlig gjennom de av Gram-negative bakterier . Viktigere, tHan analysen vises veldig robust som en robust z &#39;verdi konsekvent over 0,5 ble observert i alle skjermene til dags dato. Screening ved anvendelse av denne protokollen vil avdekke et antall av små molekyler som hemmer og / eller fremmer intracellulære c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa. Videre har denne analysen også har potensial til å identifisere baktericide eller bakteriostatiske forbindelser som resulterer i en reduksjon i OD600 utlesning. Selv om det ikke er omtalt i protokollen delen, er det flere viktige betraktninger for fremstilling av forsøket. Det er viktig å huske på at GFP bioreporter er basert på et plasmid. Selv om reporter plasmid er kjent for å være meget stabil i P. aeruginosa, kan det være tapt etter kontinuerlig re-plating, derav behovet for å bruke ferske belagt stammer fra en -80 ° C glyserol lager, og sjekke fluorescens uttrykk er avgjørende. Det er også meget verdifull for å opprettholde ensartede vekstbetingelser i hele skjermensiden eventuelle svingninger i disse forholdene kan ha ringvirkninger på skjermen. Dette vil inkludere gjør sikkert at media og antibiotika er forhåndslagde i batch og brukes i løpet av skjermen. Bakteriekulturer ikke vokser (basert på OD 600 leser-outs) på en ensartet måte er et vanlig problem for de fleste high-throughput skjermer av denne art. Dette kan være på grunn av kanteffekter eller tappe en ikke-homogen bakteriekultur inn i platene. For den tidligere, noe som gjør at en gass-gjennomtrengelig pakning brukes under inkubasjon er avgjørende. Mens for de sistnevnte, grunning væskebehandler røret med et volum av kulturen minst tre ganger dødvolumet av røret i seg selv er anbefalt. Det er viktig å holde magnetrører ved minimal hastighet under utlevering. Mens overvåking og lagring av de 384-brønns plater for jevn vekst i løpet av forsøkene er av vesentlig betydning, en situasjon for å unngå er stabling av platene i løpet av inkuberingen som det kan føre unønsket oksygen gradienter som fører til en skjevhet i vekstmønster. Det er også viktig å sikre at kjøretøyet DMSO anvendt som en negativ kontroll ikke blir negativt påvirket vekst av stammen av interesse. Mange av disse problemene forbundet med vekst kan unngås ved å utføre en uekte skjerm med bakteriestammen av interesse før screening. Tolking også fordeler det hensyn at c-di-GMP-inhiberende Resultatene beregnes ved endringen i vilkårlige fluorescens intensitet heter som må korrigeres for endringen i celletetthet. Med dette i tankene forskjellige matematiske formler for å vurdere datautgang fra disse eksperimentene bør også tas i betraktning. For eksempel kan en forbindelse vises som en c-di-GMP-inhibitor, men faktisk være en vekstinhibitor eller vice versa, noe som krever forsiktig tolkning av identifiserte treff. Det er flere ulemper og begrensninger som må vurderes under utviklingen og utførelsen av dennehigh-throughput celle-basert skjerm. For eksempel er de bio-rapportør funksjoner på et indirekte mål på cellulære c-di-GMP-nivåer ved hjelp av en fluorescerende probe som deteksjonsegenskapene kan potensielt bli påvirket av små molekyler som brukes i en skjerm. En tangentiell problemet er det faktum at det cellebaserte analysen gir ingen informasjon om mekanismen bak endringer i nivåene av intracellulær c-di-GMP. Derfor må viktige observasjoner fra forsøk bekreftes ved hjelp av en væskekromatografi-massespektrometri tilnærming, som regnes som den &quot;gullstandarden&quot; metode for å måle intracellulære c-di-GMP svingninger i bakterier. Videre kan vår fremgangsmåte bare gi informasjon angående virkemåten av bakterier som var dyrket in vitro, som bakterieceller dyrket i sammenheng med verten (in vivo) raskt endre sine aktiviteter på grunn av dette miljøet. Videre er prosessen med å bruke en GFP bioreporter innebærer at skjermen ikke tari betraktning den fysiologiske statusen til bakterieceller. Imidlertid kan protokollen tilpasses mikroskopisk kontroll av individuelle brønner i løpet av skjermen. Selv med disse betraktninger og begrensninger, er dette high-throughput-analysen likevel en robust skjerm for små molekyler som er i stand til å interferere med intracellulære c-di-GMP-nivåer. Siden mange mikrobielle arter, inkludert mange bakterielle patogener har blitt studert for å karakterisere modulering av intracellulær c-di-GMP-nivåer, kan vår protokoll anvendes på forskjellige bakteriearter og utvidet til studiet av mer kompliserte flerbestands bakterier modeller. Analysen kan lett optimaliseres for andre bakterielle arter ved å forandre vekstbetingelsene som brukes, eller kan være innrettet til å lese andre utganger ved hjelp av ulike bioreporters. Forskjellige inkubasjonstider kan brukes, avhengig av vekstfasen av interesse. Men når du skalerer opp eller øke gjennom-put, er det importan<html> t å huske på at bakterier vil fortsatt være økende i løpet av plate forberedelser og avlesnings målinger. Derfor anbefales det å skjerme maksimalt 15 plater på en gang ved hjelp av denne protokollen. Dessuten, ved bruk av plater med mer enn 384 brønner er det ikke mulig ensartet vekst, noe som krever ytterligere optimalisering. Når skalere ned antall plater, kan det være mer hensiktsmessig å inokulere manuelt ved hjelp av en elektronisk pipette i stedet for en væskehåndteringsrobot. Det er klart at denne protokollen kan bli brukt til å undersøke små molekyler som sprer biofilmer, gitt at anti-biofilm-forbindelser forstyrre c-di-GMP-signalering. Protokollen kan også bli bygget ut til å forstå ulike aspekter av bakteriell fysiologi. Gitt at c-di-GMP signalering er utbredt i de fleste bakterier, ved å studere physiologies av disse organismene bruker denne protokollen kan vi identifisere ulike kjemiske stimuli for å avgjøre hvorvidt arbeids mekanismer krever c-di-GMP signalering. _content &quot;&gt; I sammendraget, vil robusthet og allsidighet av tilnærmingen presenteres i denne protokollen hjelpe identifisering av kjemiske midler med c-di-GMP signalering i mange biologiske systemer.

Den raske utviklingen av resistens mot klinisk viktige antibiotika er en av de store bekymringene nå står overfor helsepersonell over hele verden. Dette svikt i tradisjonelle antibiotika har drevet nye søk for kjemisk sak som kan forstyrre bakterie prosesser involvert i virulens og sykdomsprogresjon en. Et slikt reguleringssystem som benytter den intracellulære andre messenger syklisk di-GMP (c-di-GMP) har nylig blitt et mål med lovende gyldighet 2-4. Det er fastslått at denne globale andre messenger signalmolekyl regulerer mange funksjoner, inkludert antibiotikaresistens, vedheft, biofilmdannelse og sykdom 2-4. Det er nå klart at den cellulære nivået av c-di-GMP i bakteriecellen blir styrt av syntese og nedbrytning hvorved to molekyler av GTP blir brukt til å syntetisere c-di-GMP ved GGDEF domene-inneholdende diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP Nedbrytningen katalyseres av fosfodiesterase (PDE) som enten har en EAL eller en HD-GYP domene (anmeldt i (3, 5)). Proteiner som inneholder disse domenene inneholder ofte andre signal domener, noe som tyder på at deres aktivitet i c-di-GMP omsetning er regulert enten direkte eller indirekte av miljømessige eller mobil 3,5 signaler. Derfor c-di-GMP signale funksjoner for å knytte sensing av ulike miljø signaler om endringer i bakterie fenotype. c-di-GMP utøver sin regulerende effekt på bakterier på nivået av transkripsjon, post-transkripsjon og post-oversettelse av ulike mekanismer 4. En stor innflytelse av c-di-GMP i mange bakterieceller er i bestemmelse av bakteriell &quot;livsstil&quot; og, i særdeleshet, i kontrollen av overganger mellom bevegelige planktoniske celler og fastsittende celler festet til overflater eller organisert i de flercellede strukturer av biofilmer 3,5. Generelt, høy cellulærnivåer av c-di-GMP er forbundet med biofilmdannelse og sessility, mens lave cellulære nivåer stimulere motiliteten og virulens faktor syntese i mange bakterielle patogener 3,5. Således kan et mer detaljert kjennskap til driften av c-di-GMP-signalering gi strategier for inhibering av biofilmdannelse og virulens i bakterielle patogener. Dette er en krevende oppgave gitt at de fleste bakterielle genomer kode mange proteiner med GGDEF, EAL og / eller HD-Gyp domener (for eksempel P. aeruginosa har over 40 proteiner) og flere effektorer 6,7. Men selv med denne kompleksiteten, tyder nyere bevis for at strategiene manipulere c-di-GMP signale kan utvikles til enten å hindre antibiotikaresistente infeksjoner utvikle eller gjøre dem utsatt for immunsystemet eller effektiv behandling av samtidig bruk av klassiske antibiotika 2. I tråd med dette har det vist eksperimentelt at kunstig nedgangav intracellulær c-di-GMP in in vitro -grown P. aeruginosa fører til redusert biofilmdannelse og økt mottakelighet for antimikrobielle midler, mens P. aeruginosa -developed biofilmer på silikonimplantater, som befinner seg i bukhulen til mus, kan dispergeres på en lignende måte 8-11. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming, fluorescens-basert reporter analysen for å skjerme små molekyler som potensielt kan modulerer cellulære c-di-GMP nivåer i P. aeruginosa (figur 1). Analysen er basert på måling av c-di-GMP cellulære nivåer ved hjelp av en tidligere utviklet GFP rapportør hvis ekspresjon er transkripsjonelt bundet til c-di-GMP-responsive CDRA promoter 12. Denne protokollen beskriver metodologi for ekspresjon av reporter konstruksjonen i P. aeruginosa stamme av interesse, sammensatt plate forberedelse, kultur inokulasjon i 384-brønners plater, vekstvilkår, som vill som detaljer om datainnsamling, ledelse og analyse (figur 1). Samlet denne protokollen vil hjelpe forskere å potensielt identifisere nye forbindelser rettet mot c-di-GMP signalering i bakterier, og til bruk i forskning med sikte på å forstå biologien til P. aeruginosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L3022-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S0389-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Lysogeny Broth with Agar (Lennox)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">L2897-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">A0166-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G5516-1L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:208px;">Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">10010-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Tobramycin sulfate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">T1783-100MG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">276855-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">840-208100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">2 mm gap electroporator cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652092</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">BioRad GenePulser XCell electroporator</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:167px;">1652662</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Leica Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td style="width:208px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:167px;">MZ16FA</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">Z328952-10EA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">384-well, white-walled, clear-bottom plates</td>
			<td style="width:208px;">Greiner</td>
			<td style="width:167px;">781098</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi reagent dispenser</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">5840300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">Multidrop Combi tubing</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">24073290</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">VIAFLO II 16-channel electronic pipette</td>
			<td style="width:208px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">4642</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">100 mL sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">12399175</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:247px;">AeraSeal air-permeable membranes</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">MKBQ1886</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)</td>
			<td style="width:208px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:167px;">Pherastar FS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa

Bakteriell resistens mot tradisjonelle antibiotika har drevet forskning forsøk på å identifisere nye narkotika mål i nylig oppdagede regulatoriske veier. Regulatoriske systemer som benytter intracellulær cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en andre budbringer er en slik klasse av målet. c-di-GMP er et signalmolekyl som finnes i nesten alle bakterier som fungerer for å regulere et omfattende utvalg av prosesser inkludert antibiotikaresistens, biofilmdannelse og virulens. Forståelsen av hvordan c-di-GMP signale kontroller aspekter av antibiotikaresistent biofilm utvikling har foreslått tilnærminger der endring av mobiltelefon konsentrasjoner av nukleotid eller avbrudd av disse signalveier kan føre til redusert biofilmdannelse eller økt mottakelighet av biofilm til antibiotika. Vi beskriver en enkel high-throughput bioreporter protokollen, basert på grønt fluorescerende protein (GFP), hvis ekspresjon er under kontroll av c-di-GMP-responsive promoter CDRA, For raskt å screene for små molekyler med potensial for å modulere c-di-GMP cellulære nivåer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denne enkle protokollen kan skjermen oppover på 3,500 forbindelsene i løpet av 48 timer, og har evnen til å bli tilpasset til mange mikroorganismer.

Fremgangsmåten som er beskrevet her gjør det mulig for en enkelt forsker å effektivt og screene et gjennomsnitt på 3,500 forbindelser i en 48-timers periode. En oversikt over high-throughput screening protokollen er vist som et flytdiagram på figur 1. For den aktuelle artikkel, vi vist en rule-of-fem kompatible forbindelsen bibliotek for potensielle c-di-GMP-modulerende forbindelser ved en sluttkonsentrasjon på 600 pM . Det er imidlertid mange kommersielt tilgjengelige legemiddel-lignende og ikke-stoff som sammensatte apparater som kan brukes i analysen. Disse settene kan være bakterie fokusert forbindelser eller tilfeldige sammenslåtte forbindelser, men hvert bibliotek ville ha betinget fysisk-kjemiske egenskaper og karakteristikker som er tildelt som sett vist her, som hadde polare funksjonelle grupper og flere stereogene sentre. I denne protokollen, bakterier inokulert inn i platen sammen med forbindelsene, et antibiotikum som positiv kontroll og en DMSO kjøretøykontroll, i henhold til oppsettet vist i figur 2. Figur 3 viser resultatene av den primære undersøkelses eksemplifisert ved et enkelt bibliotek plate. Representative OD 600 og GFP rådata er vist i figur 3A og 3B, respektivt. En farge gradient varmekartet, med varm (rød) for å avkjøle (grønn) farger som indikerer lav til høy OD 600 / GFP-verdier, har vært anvendt til brønn verdier. Varme kartene ble generert i et regnearkprogram ved å bruke en tre-farge skala betinget formatering som spenner fra det laveste OD 600 / GFP lese-out opp til det høyeste OD 600 / GFP leses ut. Lav OD 600 og GFP-verdier i forhold til DMSO negative kontroll tilsvarer en inhibering i vekst og c-di-GMP-nivåer henholdsvis, mens høye verdier i forhold til DMSO negative kontrollen tilsvarer en kampanje i vekst og c-di-GMP-nivåer henhold . Den robuste z &#39;verdier for OD 600 og GFP are beregnet i henhold til formelen gitt i protokollen (5,1). Siden de begge er over 0,5 (henholdsvis 0,694 og 0,761), ble analysen kvalitet ansett robust og dataene ble ytterligere analysert. % Inhibering av vekst (OD 600) og intracellulær c-di-GMP-nivå (GFP) beregnes ved formlene som er gitt i den protokoll (5.2, 5.3). Representative data er vist i figur 4A og 4B hhv. En farge gradient varmekartet, med varm (rød) for å avkjøle (grønn) farger som indikerer lav til høy% inhibering, er blitt utøvet på brønn verdier. Et spredningsdiagram av% hemming (OD600 / GFP) fra individuelle brønner basert på den primære skjermen er plottet i Figur 5A og 5B for OD 600 og GFP data hhv. A ± 50% cut-off (indikert med stiplede linjer) er valgt for hit deteksjon. Potensielle treff basert på denne cut-off er merket med røde prikker. To typer av forbindelser av interesse kan være discerned fra analysen. Treff identifisert i figur 5A er forbindelser som hemmer bakteriell vekst, mens treff identifisert i figur 5B er forbindelser som potensielt har evnen til å modulere intracellulære nivåer av c-di-GMP. To forbindelser som har blitt identifisert som representative treff for denne analysen. Disse er forbindelse A, er en potensiell vekstinhibitor og forbindelse B, en potensiell c-di-GMP-inhibitor. Forbindelse A tilsvarer godt F8 i figurene 3 og 4, og hadde en 72.5% inhibering i vekst. Det var en forventet tilsvarende inhibering i syklisk di-GMP-nivåer. Forbindelse B tilsvarer vel K3 i figurene 3 og 4, og hadde en 61% inhibering i syklisk di-GMP-nivåer uten noen forandring i vekst. Velger treff Forbindelsene ble ytterligere testet ved en 10-punkts dose-responsanalyse med en toppkonsentrasjon på 2 mM og to-gangers fortynningsserie. IC 50-verdier er beregnet basert på dose-responsKurvene (figur 6A og B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> Figur 1. Oversikt: High-throughput Oppsett for screening små molekyler for sitt potensial til å modulere Cellular Nivåer av c-di-GMP i P. aeruginosa. Denne oversikten viser en trinn-for-trinn representasjon av den protokoll som brukes i denne analysen. En bakteriell koloni av P. aeruginosa er dyrket over natten i et LB startkultur. Ved hjelp av en reagentutdeler, blir cellene inokulert inn i 384-brønns plater inneholdende de valgte forbindelser. Platene ble inkubert i 6 timer, hvoretter OD 600 og GFP-verdier måles. Ved hjelp av disse leser-outs, forbindelser som påvirker de cellulære nivåer av c-di-GMP kan identifiseres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise en</a>større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . Figur 2. En 384-brønners plate kart Brukes for lite molekyl Screening Assay Forbindelsene fra biblioteket (lys blå) er porsjonert i brønner A1 - P22. Den &quot;positiv kontroll&quot; (rødt) som består av en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml tobramycin sulfat blir tilsatt til brønnene A23 - P23 og &quot;negativ kontroll&quot; (grønn) som inneholdt en endelig konsentrasjon på 1% DMSO ble tilsatt til brønnene A24 - P24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> Figur 3. Representant Resultater for One 384-brønnen Screening Plate. Representative rådata er for OD 600 (A) og GFP (B). En farge gradient varmekartet, med varmt (Red: OD 600 = 0,65 eller GFP = 250000) for å kjøle (Grønn: OD 600 = 0,10 eller GFP = 40000) farger som indikerer lave til høye verdier, har blitt brukt til brønn verdier. Wells som har lavere OD 600 / GFP avlesninger i forhold til DMSO negativ kontroll vil tendens til å være i rødt, mens brønner som har høyere OD 600 / GFP avlesninger i forhold til DMSO kontroll vil tendens til å være i grønt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> Figur 4. Representative Resultater for Prosentvis Hemming Beregnet for en 384-brønners plate. Den analyserte% hemming data er representert både i OD 600 (A) og GFP (B) leser-outs. En farge gradient varmekartet, med varm (rød: OD 600 = -150% eller GFP = -20%) for å avkjøle (Grønn: OD 600 = 100% eller GFP = 100%) farger som indikerer lav til høy hemmingsverdier, har vært anvendt på brønn verdier. Små molekyler, noe som potensielt hemmer vekst og intracellulær c-di-GMP vil tendere til å være i grønt mens små molekyler som potensielt fremmer vekst og intracellulære c-di-GMP nivåer vil tendere til å være i rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> Figur 5. Representative Scatter Tomter% Hemming (OD600 / GFP) oppnådd fra hvert Testet lite molekyl. Hver lite molekyl er representert med en prikk og% hemming distribusjonfor hver av de OD 600 (A) og GFP (B) leser-outs er vist. A ± 50% cut-off er valgt for hit identifikasjon. Potensielle treff er uthevet i rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> Figur 6. Representative resultater fra en Dose -. Response Analyse To forbindelser (potensiell vekst inhibitor A og potensial c-di-GMP inhibitor B) identifisert fra tidligere skjermer er videre testet i en 10 punkt dose-respons-analyse med en topp konsentrasjon av 2 mM og to-gangers fortynningsserie. Montering av fire-parameter logistikkfunksjonen til dataene, ga IC 50 verdier av 158 mikrometer og 193 mikrometer henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ase klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Denne artikkelen beskriver high-throughput analysen som er opprettet for å screene store biblioteker av små molekyler for deres potensielle evne til å manipulere cellulære nivåer av syklisk di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, som gir en ny kraftig verktøy for antibakterielle medisiner og sammensatte testing.

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Kultur av liten koloni variant av Pseudomonas aeruginosa og kvantasjon av sin Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket inokulasjonmodell av kroniskpseudomonas aeruginosa sårinfeksjon

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...