Name: hplc-based assay to monitor extracellular nucleotide/nucleoside metabolism in human chronic lymphocytic leukemia cells
Uploaded: 2016-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells at JoVE.com

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CLL血液試料を研究所のガイドライン及びヘルシンキ宣言に従って得られます。 CLL患者の血液サンプルから白血病リンパ球の1の単離<ol><li>ヘパリンナトリウム（グリーン・トップ）チューブ17内の血液サンプルを採取します。 </li><li> RT 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全血の3希釈：1にします。 </li><li>密度勾配遠心分離により血液試料から末梢血単核細胞（PBMC）を精製します...

<ol>
	<li>Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis.">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li><li>Nemeth, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptor+activation+ameliorates+type+1+diabetes.">Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes.</a> FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).</li><li>Fan, M., Jamal Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+adenosine+in+airway+inflammation+in+an+allergic+mouse+model+of+asthma.">Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma.</a> Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).</li><li>Csoka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A2B+adenosine+receptors+protect+against+sepsis-induced+mortality+by+dampening+excessive+inflammation.">A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation.</a> J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).</li><li>Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosinergic+cardioprotection:+multiple+receptors,+multiple+pathways.">Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways.</a> Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).</li><li>Ohta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A2A+adenosine+receptor+protects+tumors+from+antitumor+T+cells.">A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).</li><li>Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptors:+therapeutic+aspects+for+inflammatory+and+immune+diseases.">Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).</li><li>Cronstein, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine,+an+endogenous+anti-inflammatory+agent.">Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent.</a> J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).</li><li>Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+transporter+proteins.">Nucleoside transporter proteins.</a> Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).</li><li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+generation+catalyzed+by+CD39+and+CD73+expressed+on+regulatory+T+cells+mediates+immune+suppression.">Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression.</a> J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).</li><li>Linden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+function+by+adenosine+receptors.">Regulation of leukocyte function by adenosine receptors.</a> Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).</li><li>Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation+and+cancer:+a+leading+role+for+adenosine.">Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).</li><li>Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+and+inflammation:+what's+new+on+the+horizon.">Adenosine and inflammation: what's new on the horizon.</a> Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).</li><li>Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+lymphocytic+leukemia.">Chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).</li><li>Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase-1+(E-NTPDase1/CD39)+as+a+new+prognostic+marker+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).</li><li>Serra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-generated+extracellular+adenosine+in+chronic+lymphocytic+leukemia+creates+local+conditions+counteracting+drug-induced+cell+death.">CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death.</a> Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).</li><li>Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+methods+affect+cellular+protein+integrity:+implications+for+clinical+trial+biomarkers+and+ZAP-70+inn+CLL.">Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL.</a> Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+and+ZAP-70+are+functionally+linked+and+mark+CLL+cells+with+high+migratory+potential.">CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential.</a> Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).</li><li>Sachsenmeier, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ectonucleotidase+assay+suitable+for+high-throughput+screening.">Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、精製されたヒト白血病細胞からの細胞培養培地中のCD39 / CD73アデノシン機械の活性を評価することを可能にします。このHPLC法を通して、私たちは以下の通りと定量的にADO（CD73依存）とINOへのその後の分解（CD26 / ADA依存）の酵素的生成を測定することができます。酵素阻害剤の使用は、プロトコルを制御するために、内部コントロールを有することを可能にし?...

アデノシン（ADO）は、グリコシド結合を介してリボース糖の分子部分に結合したアデニン分子とプリンヌクレオシドです。ときに細胞外環境中に存在し、それは、免疫系の作用によって過度の損傷から細胞を保護します。この役割は、大腸炎1、糖尿病2、喘息3、敗血症4、及び虚血性損傷5のような異なる疾病モデルを使用して強調されています。メインADO機能の一つは、腫瘍免疫回避6に貢献し、腫瘍微小環境における免疫応答の阻害です。この理由のために、ADO形成およびシグナル伝達に関与するメカニズムは、かなりの治療上の関心7です。 ADO組織微小環境中のレベルは、正常な生理学的条件下では相対的に低く、確かに免疫細胞の感度閾値以下。しかし、低酸素症、虚血、炎症、感染症、代謝中ストレスや腫瘍変換が、彼 ​​らは急速に8を高めます。オートクリンおよびパラクリン方法で、組織の損傷を報告するために、一般的に細胞保護とみなすことができる組織応答を生成する：組織摂動信号に応答して上昇した細胞外ADOレベルは二重の機能を持っています。 細胞外ADOが原因アデノシンデアミナーゼによって操作損なわ分解のヌクレオシド輸送体9または蓄積によって媒介される細胞内コンパートメントからの放出を含む機構の様々なを通じて形成することができます。増加した細胞外ADOレベルに至る主な経路は、死んでいるか死にかけている細胞から放出されたヌクレオチドのphosphohydrolysisによってADOを生成する膜関連ectoenzymesあるectonucleotidases、のカスケードの作用を伴います。この経路は、CD39の連続作用を介して進行する（ectonucleoside三リン酸ジホ-1）細胞外アデノシン5&#39;-三リン酸に変換します（ATP）またはAMPは10を ADOに変換アデノシン5&#39;-一リン酸（AMP）およびCD73（5&#39;-ヌクレオチダーゼ）のアデノシン5&#39;-二リン酸（ADP）、。 細胞外ADOは4貫通ADOの受容体、すなわちA1、A2A、A2BおよびA3に結合することによって、その生理学的応答を誘発します。各受容体は、ADOおよび特定の組織分布に対して異なる親和性を持っています。すべての受容体は、7回膜貫通ドメインを有し、（Gタンパク質）を誘導または阻害することができる細胞内のGTP結合タンパク質（Gタンパク質）に結合したGタンパク質（GIタンパク質）アデニル酸シクラーゼ活性と、続いて、細胞内cAMPの産生です。生理学的反応11中の細胞内タンパク質キナーゼ活性のため、細胞内cAMPレベルの変化が影響。生理学的条件下で細胞外ADOは無差別A1、A2AおよびA3受容体を活性化することができ、1μM、以下です。しかし、A2Bサブタイプの活性化は、かなり高い必要このような病態生理学的条件の下で生成されるようなヌクレオシドの濃度は、。あるいは、細胞外ADOは、アデノシンデアミナーゼ（ADA）とCD26、細胞表面上のADAを局在ADA錯化タンパク質によってイノシン（INO）に分解することができます。別の可能性は、ADOがADOキナーゼタンパク質12,13によってAMPにequilibrativeなヌクレオシドトランスポーター（ENT）およびリン酸化を介して細胞によって内在化されることです。 このプロトコルの目的は、ヒトのリンパ球によって生成されるように、単一の実行で基板AMP及び製品ADOとINOを定量化するために、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の分析法を記載することです。我々の経験は、最初に構成CD39 14,15を発現する CD19 + / CD5 + Bリンパ球の成熟集団の増殖によって特徴付けられる慢性リンパ球性白血病（CLL）患者由来の細胞を用いて得ました。我々は、約30％を示しました。CLL患者のCD73の細胞外酵素を発現し、この表現型は予後不良16と相関しています。 CD39およびCD73を共発現する白血病細胞のこの亜集団は、積極的にADPおよび/またはAMPから細胞​​外ADOを生成することができます。 α、βメチレン- ADP（APCP）、CD73酵素活性の既知の阻害剤とCD73 + CLL細胞、完全に遮断外ADO合成のプレインキュベーションは、CD73がそのカスケード16のボトルネック酵素を表していることを確認しました。 CLL細胞はまたINOへのADOの変換に関与しているADAおよびADA複合体形成タンパク質CD26を発現します。そのようなエリスロ-9-などの特定のADA阻害剤を用いて（2-ヒドロキシ-3-ノニル）Iはwiadenine（EHNA）塩酸塩およびデオキシコホルマイシン（DCF）、それはINOに外ADO劣化を阻止することが可能です。また、ジピリダモールと組み合わせて、ADA阻害剤での前処理は、ブロックヌクレオシドトランスポーターということは、細胞内のADOの蓄積を強化します上清。 それから、CD73依存ADOの生産を確認し、Tリンパ球および骨髄細胞を含む他の系統に由来する細胞に、このプロトコルを拡張しました。これらの知見は、このHPLCプロトコルは非常に汎用性があり、それは、異なる細胞系統に異なる培養条件（ 図1）に適用することができることを示唆しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig1.jpg" /> 図1 の細胞外ADOの産生を担う酵素機構の略図。アデノシン5&#39;-三リン酸（ATP）および/ ​​またはアデノシン5&#39;-二リン酸（ADP）は、アデノシン5&#39;-一リン酸（AMP）へのCD39によって分解することができ、その今度は、ヌクレオシドアデノシン（ADO）にCD73によって変換されます。 ADOは、細胞外空間に生成されると、それは、ヌクレオシド輸送体（ENT）を介して細胞を再入力することができる、イノシンに変換する（INO）またはP1 ADO受容体の異なるタイプに特異的に結合する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>double deionised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-CD3, -CD14, -CD16</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td>mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled anti-CD19</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>120-014-229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled anti-CD5</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E404-200TABS</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ID bio</td>
			<td>1000-70</td>
			<td>standard grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM V serum free medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12055-091</td>
			<td>liquid (research grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine 5&#8217;-diphosphate (ADP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine 5&#8217;-monosphate (AMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine (ADO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inosine (INO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;,&#946;-methylene-ADP (APCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8386</td>
			<td>CD73 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHNA hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E114</td>
			<td>adenosine deaminase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycoformycin (dCF)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2033</td>
			<td>adenosine deaminase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipyridamole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9766</td>
			<td>nucleoside transporter inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile (CHROMASOLV Plus)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>HPLC-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9688</td>
			<td>7 mM, pH 3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721-1L</td>
			<td>min. 37 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:235px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Equipment</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B&#252;rker cell counter</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0920</td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12301D</td>
			<td>Dynal magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microcentrifuge safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>030-120-0086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PET centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430053/430304</td>
			<td>15 &#8211; 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minisart RC4 syringe filters</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>17821</td>
			<td>membrane 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">short thread vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0029</td>
			<td>1.5 ml/glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micro-inserts</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0006</td>
			<td>0.1 ml/glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0085</td>
			<td>9 mm/PP blue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Atlantis dC18 Column</td>
			<td style="width:168px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001344</td>
			<td>5 &#181;m, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Atlantis dC18 Guard Column</td>
			<td style="width:168px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001323</td>
			<td>5 &#181;m, 4.6 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Alliance 2965 Separations Module</td>
			<td style="width:168px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>HPLC separation module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector</td>
			<td style="width:168px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Waters Empower2 software</td>
			<td style="width:168px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc-based assay to monitor extracellular nucleotide/nucleoside metabolism in human chronic lymphocytic leukemia cells

この方法は、異なる培養条件下で精製した慢性リンパ球性白血病（CLL）細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチド及びヌクレオシドの定量化のために開発、検証、敏感な特定の、信頼性が高く再現可能な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）アッセイを記載します。アデノシン5&#39;-一リン酸（AMP）、アデノシン（ADO）とイノシン（INO）のクロマトグラフィー分離は、極性化合物の保持のために使用されるシリカベースの逆相カラム上でRTで行われます。方法/分1.00 mlに、流速と7mMの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルから成る2成分移動相を含みます。溶出液を260nmで設定フォトダイオードアレイUV検出器を用いて監視されます。標準検量線は、各プリン化合物の分析的定量化のための方程式を計算するために生成されます。システム制御、データ収集および分析が次に実施されます。このプロトコルを適用すると、AMP、INOとADOは、それぞれ、7、11および11.9分で溶出し、各試料の総実行時間は20分です。このプロトコルは、マトリックスとして培地を使用して、異なる細胞型および細胞株（懸濁および接着の両方）に適用されてもよいです。利点は、簡単かつ迅速に試料調製及び分析のために上清の少量の要求です。また、無血清培地の使用は、その影響のプリン化合物の最終濃度をアセトニトリルによるタンパク質沈殿のステップをスキップできます。この方法の制限の1つは、より長い実験の合計実行時間を製造し、ハイスループットスクリーニング適用を防ぐ、各単一のサンプルのランの前に平衡化カラムをランの要件です。

代表的なCLL患者から新たに精製したPBMC中の白血病細胞の割合（％）を評価するために、細胞を抗CD19および抗CD5抗体でマークされています。 図3の左側のパネルには、生きた細胞に選択ゲートと細胞蛍光ドットプロットを表している。 図3は、（中央パネル）の前にCLL患者からのPBMCの一例を示し、（右パネル）B細胞の精製後。 <p class="jove_co...

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HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Research

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Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

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高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

F− 310 Nm 剥離によって示されている陰イオンの光電子イメージング

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

薬物薬物動態および毒物学的評価のための腸/肝臓微生理学的システム

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

新しい天然物を発見するためのツールとしての質量分析誘導ゲノムマイニング

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...