Name: site directed spin labeling and epr spectroscopic studies of pentameric ligand-gated ion channels
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels at JoVE.com

We zijn erg dankbaar voor de huidige en voormalige leden van de Chakrapani lab voor kritisch lezen en opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​(1R01GM108921) en de American Heart Association (NCRP Wetenschapper Development Grant 12SDG12070069) en SC.

1. Site mutagenese en Cys Mutaties <ol><li> Klonering en mutagenese OPMERKING: GLIC wildtype (wt) 35 heeft een natieve cysteïne (C27), die is gemuteerd naar serine-cysteïne een minder achtergrond te maken. Cysteïne mutaties worden geïntroduceerd op de cysteïne-less achtergrond door plaatsgerichte mutagenese onder toepassing van primers die een cysteïne codon voeren op de gewenste positie 36. <ol><li> Meng 5 ui 10x reactiebuffer, 1 pi 100 ng / ul cysteine-loze GLIC matrijs DN...

EPR spectroscopie heeft zich bewezen als een ongeëvenaarde structurele aanpak in het kwantificeren van conformationele veranderingen in membraaneiwitten in een near-native omgeving. Deze aanpak stelt ons in staat een kijkje in de moleculaire details van eiwitten dynamiek die in hoge resolutie structuren worden verduisterd van X-ray kristallografie en Cryo-elektronenmicroscopie. Het is echter belangrijk om het technische beperkingen van deze benadering die de algemene toepasbaarheid beïnvloeden andere systemen en ook r...

In de afgelopen tien jaar is de structurele begrip van pentamere-Ionotrope receptor (pLGIC) gegroeid in sprongen en grenzen, als gevolg van massa&#39;s met een hoge resolutie structuren van een aantal leden van de familie. Belangrijke factoren die tot de huidige ontwikkelingen op het gebied omvatten de ontdekking van prokaryote pLGIC kanalen 1-3 belangrijke vooruitgang in eukaryote membraan eiwitexpressie 4-6 en enorme doorbraken in structuurbepaling benaderingen. 7 Deze structuren een duidelijke consensus de totale bescherming van de driedimensionale architectuur van pLGIC. Echter, twee belangrijke gebieden die lijken te achter parcours zijn de functionele karakterisering van deze kanaal voorbereidingen en de mechanistische beschrijving van het kanaal functie. Gating conformationele veranderingen zijn complex en komen dus op 60 een afstand langs de lengte van het kanaal en deze overgangen worden uitgebreid gemoduleerd doormembraanlipiden. Met name negatieve lipiden, cholesterol en fosfolipiden blijkt de functie van pLGIC 8-11 moduleren. Hoewel de precieze rol van deze lipide bestanddelen in kanaal functie nog onbekend is, zou een volledige moleculaire begrip van gating vereist het bestuderen van deze kanalen in hun eigen omgeving. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) en elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie zijn de technieken van de keuze voor het bestuderen van eiwit dynamiek in opgeloste systemen. EPR spectroscopie wordt niet beperkt door de molecuulgrootte (volgens NMR) of optische eigenschap van het monster (volgens fluorescentiespectroscopie), waardoor aldus metingen van volledige lengte constructen opgelost in lipide natieve omstandigheden. De techniek is zeer gevoelig en heeft een relatief lage eisen monster (in de pico-mol bereik). Beide aspecten maken de techniek zeer geschikt voor het bestuderen van grote membraaneiwitten die moeilijk in te drukken in milligramhoeveelheden. Het gebruik van EPR spectroscopie gecombineerd met plaatsgerichte spin labeling werd ontwikkeld door Wayne Hubbell en collega&#39;s, en is aangepast voor het bestuderen van verschillende types eiwit. 12-24 EPR gegevens werden gebruikt om secundaire structuren te onderzoeken, veranderingen in het eiwit conformatie, membraan-insteekdieptes en eiwit-eiwit / eiwit-ligand interacties. De werkwijze omvat cysteïne vervanging op posities plaats door plaatsgerichte mutagenese. Sitespecifieke labeling waarborgen, is het noodzakelijk om natieve cysteïnes te vervangen door een andere aminozuur (bijv. Serine) een cysteïne-less sjabloon. Verreweg de meest populaire spinlabel een thiol-specifieke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate die hecht aan het eiwit via een disulfidebinding brug. Door de hoge specificiteit, relatief kleine omvang (iets groter dan tryptofaan) en flexibaarheid van het linkergebied, heeft deze spinlabel aangetoond uitstekende reactiviteit zelfs met een begraven cysteïne. Voorts tot de reactiviteit te maximaliseren, de markeringsreactie van het eiwit wordt uitgevoerd in de detergens gesolubiliseerde vorm uitgevoerd. Na afscheiding van de overmaat vrije spin-label door gelpermeatiechromatografie, wordt het eiwit opgelost in liposomen of bilaag nabootsen systemen gedefinieerde lipidesamenstelling. In het algemeen wordt cysteine ​​mutagenese goed verdragen in de meeste delen van het eiwit en de betrekkelijk geringe omvang van de spin-probe geeft vrijwel geen storing van de secundaire en tertiaire structuren. Opdat de modificatie vastgehouden wildtype functies kunnen het gemerkte en geregenereerde kanalen worden bestudeerd door de patch-clamp metingen. Het gemerkte-functioneel eiwit wordt vervolgens onderworpen aan spectroscopische metingen, die in wezen bevatten drie hoofdtypen informatie: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamica van lineshaap analyse; toegankelijkheid van de sonde te paramagnetische ontspanning agenten; en afstand distributie. 27 EPR afstanden worden gemeten door twee verschillende benaderingen. De eerste is gebaseerd op de Continuous Wave (CW) techniek, waarbij spectrale verbreding gevolg van dipolaire interacties tussen spin-labels (in de 8-20 Å afstandsbereik). Wordt gebruikt om de afstand te bepalen 28,29 De tweede is een gepulste EPR methode waar afstand metingen tot 70 Å. 30-34 kan worden verlengd in Double Electron Electron Resonance (herten), oscillaties in de spin-echo amplitude worden geanalyseerd om afstanden en de afstand distributies te bepalen. Hier de spin echo gemoduleerd op de frequentie van de dipool interactie. Samen worden deze parameters gebruikt om eiwit topologie, secundaire structurele elementen, en eiwit-conformationele veranderingen te bepalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PfuUltra HF reaction buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600380-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>New England BioLabs Inc&#8206;</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>10mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pfu Ultra DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600380-51</td>
			<td>2.5 U/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPNI</td>
			<td>New England BioLabs Inc&#8206;</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>20,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10 GOLD</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC media</td>
			<td>New England BioLabs Inc&#8206;</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientfic</td>
			<td>BP905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>127957084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C43 competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression and Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientfic</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-thio-&#946;-galactoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM (n-Docecyl-&#946;-D-Maltopyranoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England BioLabs Inc&#8206;</td>
			<td>E8021L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientfic</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>329915000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empty polypropylene Chromatography column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Spin Labeling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate</td>
			<td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td>
			<td>O873900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-&#916;3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate</td>
			<td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td>
			<td>A167900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9224-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin lipid</td>
			<td>Avanti polar lipids Inc</td>
			<td>541602C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biobeads (Polystyrine beads)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher chemicals</td>
			<td>A413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRET</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-maleimide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine-maleimide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T-6027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti polar lipids Inc</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPG</td>
			<td>Avanti polar lipids Inc</td>
			<td>840457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti polar lipids Inc</td>
			<td>100600C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPR measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPX plastic capillaries</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ER221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDDA (Ethylenediamine-N, N&#39;-diacetic acid)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>158186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(OH)2</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>283622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site directed spin labeling and epr spectroscopic studies of pentameric ligand-gated ion channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

Biochemische karakterisering van Spin gelabelde GLIC Mutants Na de hierboven beschreven protocol zou levert doorgaans GLIC MBP-fusie-eiwit in het traject van 10 - 12 mg / l cultuur. Hoewel deze waarde kan variëren in verschillende mutanten, in het bijzonder voor functies begraven in het eiwit, kan de opbrengst aanzienlijk worden aangetast. In deze gevallen kan het kweekmedium volumes vereisen schaalvergroting...

Watch this Scientific Journal Video about Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels at JoVE.com

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentatie Evenwicht van een Kleine Oligomeer-vormende membraaneiwit: Effect van histidine Protonering op pentamere Stabiliteit

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Vervoer van oppervlakte-gemodificeerde koolstof nanobuisjes via een bodem Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

Diffuse Reflectance Infrared Spectroscopic Identification of Dispersant/Particle Bonding Mechanisms in Functional Inks

Diffuse reflectie infrarood spectroscopische Identificatie van Dispergeermiddel / Particle Bonding Mechanismen in Functional Inks

In additive manufacturing, or 3D printing, material is deposited drop by drop, to create micron to macroscale layers.  A typical inkjet ink is a colloidal ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

A-filter op basis Surface Enhanced Raman spectroscopische test voor snelle opsporing van chemische verontreinigingen

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Met behulp van cyclische voltammetrie, UV-Vis-NIR en EPR Spectroelectrochemistry voor het analyseren van organische verbindingen

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, Crystallization, and Spectroscopic Characterization of 3,5-Lutidine N-Oxide Dehydrate

Syntheses, kristallisatie en spectroscopische karakterisering van 3,5-Lutidine, N-Oxide uitdrogen

The synthesis of 3,5-lutidine N-oxide dehydrate, 1, was achieved in the synthesis route of 2-amino-pyridine-3,5-dicarboxylic acid. Ochiai first used the ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...