Name: generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00
Duration: 6 min 9 s
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本稿では、単球、未成熟MoDCを、寛容原性のMoDCと成熟したMoDCから生成する方法について説明します。このプロトコルにおける重要なステップは、以下の段落で詳細に説明します。ヒト末梢血は、このプロトコルで出発原料として使用され、ヒトの血液を処理するための普遍的な予防措置が実施されるべきであることに留意することが重要です。それは、ヒト24に骨髄からDCを導出することは技術的に可能であるが、末梢血中に見出される細胞からin vitroで DCの分化を伴う骨髄と比べて、末梢血の利用に好適です。末梢血中に見出される細胞、造血CD34 +幹細胞および単球の間で一般的にDCのin vitroでの生成のために使用されます。造血CD34 +細胞は、その後さらにランゲルハンスに分化されたCD1a +およびCD14 +サブセットを導出するために、GM-CSFおよびTNF-αと共に培養する幹細胞および樹状細胞などが挙げられます。逆に、単球を未成熟のMoDCを生成するために、GM-CSFおよびIL-4で培養されます。いくつかのプロトコルは、末梢血からの単球の濃縮のために使用されます。 。例えば、プラスチック皿、水簸および分離キット25、26への付着により付着プロトコルの利点は、細胞への最小限のダメージであり、比較的しかし、細胞の純度が損なわれる可能性があり、費用対効果。余分なステップは、さらなる実験のために細胞を剥離するために必要とされます。水簸は、それらのサイズおよび密度に基づいて細胞を分離する技術です。水簸の利点は、細胞生存率であり、単球は、容易に、さらなる実験のために使用することができます。しかし、この技術は、水簸機の利用可能性と同様の堆積パラメータを有する細胞（T細胞および単球）の異なる集団を分離することができないことによって制限されます。市販の単離キットは、いずれかの積極選択するために、磁気マイクロビーズを利用したり負の単球集団を選択します。分離された単球が（マーカーまたはマイクロビーズによって結合されていない）「そのまま」のままとして、いくつかのプロトコルは、負の選択を用いて単球の分離に偏っています。このプロトコルでは、CD14ビーズをPBMCから正の選択ヒト単球に使用されました。 CD14は細胞質ドメインを欠いており、CD14への抗体の結合は、シグナル伝達を誘発しません。また、マイクロビーズは、培養後の単球から分離させますので、分化過程を妨げません。また、CD14は強く、ほとんどの単球に弱く、好中球およびいくつかの骨髄樹状細胞、他の方法17よりも高い細胞純度の単離結果のためこの方法で発現されます。 血液単球は、DCまたはマクロファージに分化することができ、単球の運命は大きくサイトカイン環境に依存します。本論文では、MoDCをは（GMを顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を添加することによって生成されますヒト末梢血単核球に-csf）およ​​びインターロイキン4（IL-4）。 GM-CSFは、単球の生存のために必要とされ、IL-4はマクロファージ分化に対する阻害活性を発揮します。及び単球へのGM-SCSFおよびIL-4の組み合わせの添加は、個々のサイトカイン27に比べて未成熟のMoDCの高いパーセンテージを得ます。末梢血単核球28、29、30、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロンα（IFN-α）およびインターロイキン13（IL-13）を添加することによりたMoDCを生成する他のプロトコルがあります。 GM-CSFおよびIL-4の組み合わせは、現在、免疫原性または寛容原性のMoDCに分化およびTh1、Th2のか、Th17の促進のMoDCに偏光したプラスチック製の未成熟DCを生成受け入れプロトコルを1990年代に最適化しました。 未熟たMoDCは、ビタミンD3およびデキサメタゾンの添加により寛容原性のMoDCに分化されています。例えば寛容原性DCを生成するには、いくつかのプロトコルを介しがあります核因子カッパB（NF-κB）阻害は、βカテニンの活性化、ビタミンD3、デキサメタゾン及びラパマイシン31、32、33、34、35、9、36、37。単独で、ビタミンD3およびデキサメタゾンの両方は、DC、個々の薬剤を使用した場合よりもalloproliferationの高い抑制ビタミンD3およびデキサメタゾンの結果の組み合わせに寛容原性効果を誘導することが報告されています。したがって、寛容原性樹状細胞の生成のための既存のプロトコルは、ビタミンD3およびデキサメタゾンの組み合わせに変更されました。この方法は、現在、治療上の有用性を有するヒト寛容原性DCのモデルとして受け入れられています。再構成されたビタミンD3およびデキサメタゾンは、短い貯蔵寿命を有することに留意することも重要です。 このプロトコルでは、リポ多糖（LPS）は、DCの成熟誘導剤として添加しました。未熟たMoDCはまた、炎症誘発性カクテルを使用して成熟するように誘導することができます。（TNF-α）、インターロイキン1ベータ（IL-1β）、インターロイキン6（IL-6）およびプロスタグランジンE2）や炎症性サイトカイン（TNF-αおよびインターフェロンγ（IFN-Γ））。プロ炎症性カクテルは高い共刺激及び遊走機能を持つ成熟したMoDCを生成するが、それらは、IL-12 38の比較的低いレベルを生成します。 TNF-αまたはIFN-Γは、単独で安定した樹状表現型39を誘導することができません。 LPSは、Toll様受容体4（TLR4）を刺激するDCの成熟を誘導するためにNF-κB及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）の活性化を媒介します。 LPSによって誘導されるDCの成熟は、DC成熟マーカー（CD83、CD86、HLA-DR）のアップレギュレーションを示し、また、IL-12p70の産生のにつながりました。また、この工程は、さらなる臨床癌ワクチンのための成熟DCを産生するためにTLR3アゴニストとLPSをペアリングするように変更することができます。本論文では、寛容誘導性DCは、LPS処理時の成熟に耐性であることが示されています。これらの半成熟DCなどは免疫原性ではなく、releaしませんSE炎症性サイトカイン40。 このプロトコルの制限は、分化過程にあります。プロセスは、ハイスループット分析に適合させるために困難をもたらす日7に0日目から8日かかります。プロトコルにおける修正はまだ異なる状態で実行可能なDCの高い数値を得分化プロセスを短縮するために必要とされます。第二に、DCは、このプロトコル中のサイトカインを添加することによって生成され、これらのサイトカインは、長時間DC集団を維持しません。また、サイトカインは、 インビボでよりはるかに高い濃度で使用されており、in vivoでのDCに生理的に同一ではない経路のバイアスされた開発につながる可能性があります。例えば、DC前駆体のインビトロ培養物に インビボ 41 における通常のDCの分化に必須のサイトカインではないGM-CSFに応答することが示されています。それにもかかわらず、サイトカイン刺激は、遺伝子に有用な方法することができます実験のためのin vitroで DCの高い数字を評価します。アロ反応の研究および代謝研究、フローサイトメトリーは、このような免疫蛍光染色などの他の分析にこのプロトコルから生成されたこれらの細胞を供する能力は、この方法の有用性を増大させます。これらのインビトロ DCは、in vivoでの DCの希少数をどうする以前には困難であるDCの開発、成熟および抗原提示の知識を改善するための良いモデルとなります。 寛容対免疫学的免疫を調節する樹状細胞の能力は、それらの癌および自己免疫疾患42、43、44、45に対する治療における魅力的な候補になります。このプロトコルで生成された免疫原性DCは、感染症および腫瘍に対するワクチン接種の有効性を改善するために使用することができます。寛容原性DCは、望ましくないT細胞応答を制御し、移植後の拒絶反応を防止するために使用することができるが。複雑な免疫と寛容のバランスがDCの分化状態に非常に依存します。 DCの分化は、複数のシグナル伝達経路および代謝運命に支配される協調細胞プログラムです。 DCの異なる分化状態は、生体エネルギーと生合成のニーズが異なります。静止状態でのDCに比べて、例えば、活性化DCは、生存と移行のための重要な、よりエネルギッシュな代謝適応を必要とします。ビタミンD3、デキサメタゾン及びラパマイシンが寛容原性DCを誘導するそれらの能力について知られていることに留意することが重要であり、DC代謝に影響を与えることが記載されています。本論文では、異なる分化状態からのMoDCのエネルギー代謝は細胞外フラックスアナライザーを使用して特徴付けられたと寛容原性のMoDCは、最高の代謝の可塑性を示し、LPS誘発成熟は、この可塑性を減少させました。異化代謝の影響寛容原性DCが46を機能ながらアナボリック代謝は、DCの成熟を ​​サポートしています。 DCはこのプロトコルから生成されたが治療における免疫寛容を修正するための鍵を握るDCの代謝状態を変化させるかどうかを評価するために使用することができます。結論として、我々は、DC「免疫調節機能を研究するための重要な未成熟、免疫寛容原性と成熟したMoDCの生成のためのプロトコルを提示しました。

ヨレス1で参照されるとプロフェッショナル抗原提示細胞2としてそれらを認識し、1973年にラルフ・スタインマンとZanvilコーンによって特徴付けられるように、DCは、最初に、19世紀後半にポールランゲルハンス（ランゲルハンス細胞）によって記述されました。 DCは（ランゲルハンス細胞として存在する）、皮膚などの外部環境にして有効鼻、肺、胃や腸のライニングにさらされている組織に特に豊富で、末梢血中と身体のほとんどの組織で発見されていますそれらは、外因性抗原に遭遇します。未成熟DCは、T細胞3を刺激するエンドサイトーシス能力が、比較的低い能力を有しています。未成熟DCは、様々なパターン認識受容体（PRR）がキャプチャ病原体関連分子パターン（PAMP）または損傷関連分子パターン（DAMPS）を4発現します。自己分子がT細胞unresponsiveneもたらしながら、活性化の危険信号は、免疫原性DCの成熟に向かっを駆動しますssのアポトーシス5。免疫原性DCはMHC分子および共刺激表面分子のアップレギュレーション及びナイーブT細胞の能力6,7 ​​によって特徴付けられます。 未成熟DCはまた、ビタミンD3代謝物1aを、25（O）2 D 3と特定の免疫抑制剤、インターロイキン10（IL-10）のように、デキサメタゾン及び8-9ラパマイシンに応答したTreg誘導または寛容原性状態に向かって成熟することができます。寛容誘導性DCは表面受容体およびリガンドを含む免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（のITIM）の発現によって特徴付けられます。 ILTファミリーメンバーを含むのITIMのシグナル伝達、寛容原性DCにおけるILT3とILT4はalloproliferationを阻害したFoxp3 + Treg細胞の拡大10,11を駆動します 。寛容原性DCのこれらのユニークな特性は、in vivoでの彼らの深い効力、すなわち移植同種移植片に耐久性の寛容を誘導する能力とsupprにつながります自己免疫疾患の発症をESS。寛容原性DCは、免疫活性化の阻害において機能成熟偏DCのサブタイプとして、従って見ることができます。 形質DCと骨髄のDC 12：現在、ヒト末梢血中の樹状細胞の二つの一般的なサブセットがあります。循環DCは、ヒト血液中の白血球の2％未満になるまれであり、これは彼らの免疫調節機能を研究するためのDCの適切な数の分離に困難をもたらします。この問題を克服するために、単球分化したDCは、樹状細胞の機能の研究のためのin vitroモデルとして使用されています。これらのインビトロ DCは、in vivoでのDCと比較して類似の受容体との機能を有しています。 in vivoでの DCのおよびin vitro生成単球由来DC（MoDCを） 内の詳細な比較は、他の研究室13、14、15によって調査されています。それはまたのMoDCとCDと報告されています図1c + DCは、抗原提示及びT細胞機能15の誘導において同等でした。 本稿では、末梢血単核球から未成熟したMoDCを生成し、その後、免疫原性と寛容誘導性樹状細胞にそれらを識別する方法について説明します。これらの単球由来樹状細胞（MoDCを）は、それらの表面マーカー、サイトカインプロファイル、免疫機能および代謝状態によって特徴付けられます。免疫原性および寛容原性樹状細胞は、同種異系T細胞又は調節性T細胞のいずれかの展開をもたらす別のサイトカインを産生します。本論文では、サイトカインプロファイリングは、多重化技術を用いたシステムを用いて行われます。細胞の増殖培地は、抗体固定化色分けされたビーズと共にインキュベートし、コンパクトな分析装置に読み込まれます。 DCの代謝状態は酸素消費速度、細胞呼吸の指標、及び解糖反映する細胞外酸性化速度を測定し、細胞外フラックス分析器を用いて分析します樹状細胞内の磁束。これらの生体エネルギー率の測定は、樹状細胞の発達と機能に不可欠である細胞代謝の変化を追跡する手段を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim biotech</td>
			<td>17597</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs kit</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070103</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate 
			Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11140-040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15575</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l2755</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated HLADR&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD83&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556855</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD14&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-242</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated BDCA3&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated ILT3&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5139-73</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PerCP- conjugated Mab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400250</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PE- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			APC- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>BD LSR II&#160;</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytofix/cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/CY7-conjugated CD25</td>
			<td>BD pharmingen</td>
			<td>557753</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/CY7-conjugated CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300512</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300428</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliplex MAP Human 
			Cytokine/Chemokine 
			magnetic bead panel</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HCYTOMAG-60K</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Sheath Fluid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXMAP 3D system with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>FLEXMAP 3D</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9082</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay Medium (OCR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102352-000</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Base Medium (ECAR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000&#160;</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Cell Mito Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Glycolysis Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103020-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes

抗原非特異的な自然免疫系および抗原特異的適応免疫系との間の複雑な相互作用から免疫応答結果。免疫系は、自己分子に対する寛容性を維持し、病原体に迅速に反応するで一定のバランスです。樹状細胞（DC）は、適応免疫系に自然免疫系をリンクし、自己と非自己の間の適応応答のバランスを取る強力なプロフェッショナル抗原提示細胞です。成熟信号に応じて、未成熟樹状細胞は、選択的に、免疫原性または寛容原性樹状細胞への分化を刺激することができます。免疫原性樹状細胞は、クローン増殖のための抗原特異的T細胞に増殖シグナルを提供します。寛容原性樹状細胞は、抗原特異的T細胞の欠失又は調節性T細胞のクローン性増殖によって耐性を調節します。これによりユニークなプロパティに、樹状細胞は非常に癌や自己免疫DISEのための治療薬として後に求められていますアーゼ。樹状細胞は、インビトロで特異的抗原を装填し、免疫原性および免疫寛容の両方特異的免疫応答をマウントするために人体に注入することができます。この作品は、表面マーカーの発現、機能および代謝表現型が異なる単球、未成熟単球由来樹状細胞（MoDCを）、寛容原性と成熟のMoDCから、in vitroで生成するための手段を提供します。

単球の精製と樹状細胞の分化 単球は、CD14 +未成熟樹状細胞を得るために、GM-CSFおよびIL-4の存在下で、完全培地中で正の選択磁気分離（ 図1B）および培養（続いて、末梢血（ 図1A）の密度遠心分離によりPBMCから精製しました。 図2A）。ビタミンD3とデキサメタゾン後のGM-CSFおよびIL-4の添加は、免疫寛容のMoDC（ 図2B）に未熟のMoDCの分化をもたらしました。 LPSは、成熟（ 図2D）に対する抵抗性を検証するために、LPSで刺激したのMoDC（ 図2C）と免疫寛容誘発したMoDCを成熟する未成熟のMoDCの成熟を ​​誘導するために追加されました。この研究で使用された血液サンプルは、前の通知で健康なドナーから得ました同意。 MODCキャラクタリゼーション フローサイトメトリーによってマーカーの特徴付けを表面 DC表面マーカーの分析は、成熟したMoDCは、LPS処理寛容原性のMoDC、寛容原性のMoDCおよび未成熟したMoDC（ 図3）に比べて成熟マーカーHLA-DR、CD83およびCD86の最高レベルを発現したことが示されました。これらの結果は、寛容原性のMoDCは、LPS刺激後の未成熟したMoDCに比べて成熟に耐性であったことを実証しました。また、LPS処理寛容原性のMoDCと寛容原性のMoDCは未熟と成熟したMoDCに比べて増加したCD14の発現、BDCA3（CD141）および免疫グロブリン様転写物（ILT）3を表示しました。ここで生成された寛容原性のMoDCは、以前の報告23と一致しています。 のMoDCの機能解析 成熟のために誘発されたMoDCは、免疫原性となり、CD4 + T細胞の増殖を促進するサイトカインを放出します。我々は、共培養したT細胞の増殖を測定することにより、異なるMODC亜型の免疫原性を評価しました。 CD4 + T細胞の低alloproliferation（ 図4A）によって示されるように免疫寛容誘発たMoDCは、成熟したMoDCに比べて免疫原性に乏しいました。寛容原性たMoDCは、それらの低いIFN-ΓCD4 + T細胞（ 図4B）でalloreaction共培養において、低IL-12p40の、高IL-10サイトカイン産生によって特徴付けられます。さらに、アロ特異的CD4 + T細胞を誘導し、成熟のMoDCの共培養において寛容原性のMoDCの数を増やすとCD25 高のFoxp3 +調節性T細胞（ 図4C）の頻度を増加させました。 <pクラス= &quot;jove_content&quot; FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; ミトコンドリア活性の分析 赤色CMXRosでのMoDCにミトコンドリア膜電位レベルを分析するためにミトコンドリア活性を反映するために使用されます。寛容原性たMoDCは、他のMODC分化亜型（ 図5A）と比較してより高いミトコンドリア活性を有することが観察されました。次に、ミトコンドリアの酸素消費速度（OCR）は、バイオアナライザーを使用して異なるMODCサブタイプのために評価されます。 OCR測定は基礎呼吸、予備の呼吸容量、プロトンリーク非ミトコンドリア呼吸を含むがこれらに限定されない情報を提供する、代謝プロファイルに高解像度の洞察を可能にします。 OCRの測定は、ストレスに応答する細胞の能力を評価する手段を提供します。細胞は、代謝的に連続して三つの異なる化合物を添加することによって摂動されます。最初の注射はオルですATP合成を阻害する、電子伝達系（ETC）の複合体Vを阻害igomycin（ATPカプラー）。このステップは、ATP合成のために消費される酸素の割合とミトコンドリア内膜を横切ってプロトンリークを克服するために消費される酸素の割合を区別します。二回目の注射はせず、ミトコンドリア膜を横切っての代わりに、ミトコンドリア膜電位の崩壊はエネルギーと酸素の急速な消費につながる複合体Vのプロトンチャネルを介して水素イオンを輸送することによって、ATP合成を妨害するFCCP（ETCアクセラレータ）でありますATPの生成。 FCCPの治療は、細胞の予備の呼吸容量を計算するために使用することができます。ストレス条件下での予備呼吸容量のメンテナンスは、細胞の生存に重要です。この能力は、基板の可用性とETC.に関与する酵素の機能的能力など、いくつかの要因によって決定されます3回目の注射は、ロテノン、COMPLの組み合わせです元I阻害剤、およびアンチマイシンA、複合体III阻害剤。この組み合わせは、ミトコンドリア呼吸をシャットダウンし、OCRを損なうミトコンドリアの機能（ 図5C）の結果として減少することが観察されます。寛容原性たMoDCは、成熟したMoDC（ 図5D）よりも高い基礎OCRレベルを表示しました。また、寛容原性は、LPS-寛容原性、および未成熟MoDCを成熟したMoDC（ 図5（e））と比較して予備の呼吸容量の増加を示しました。 たMoDCの代謝特性評価 乳酸及びプロトンが解糖の間に細胞から放出されるため、我々は、細胞外酸性化（ECAR）（ 図6B）の速度のリアルタイム分析を行うことによりたMoDCの解糖活性を分析しました。グルコースの存在下では、全てのMoDCの解糖速度がで、基礎段階と比較して増加しました未熟たMoDC（ 図6D）よりも高い解糖速度を示す成熟したMoDC。寛容原性および未熟たMoDCは、LPS処理のMoDC（ 図6B）と比較して（グルコースの存在下でオリゴマイシンによって誘発される）、より高い最大の解糖を示しました。寛容原性および未成熟のMoDCの解糖能力は、成熟したMoDC（ 図6E）より高かったです。その高い解糖速度とは対照的に、解糖準備金は、成熟したMoDC（ 図 6F）で最も低かったです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> 図1：末梢血からの単球の精製 （A）は 、血液25mlを慎重に遠心分離する前に、50ミリリットルのチューブ当たりフィコール15mlの上に積層されています。 PBMCを密度遠心分離後の血漿下の層に集中している。（B）PBMCをCONJされたマイクロビーズとインキュベートします<html>ヒトCD14抗体（アイソタイプ：マウスのIgG2aを）モノクローナルするugatedした後、CD14 +単球を単離するために、セパレータの磁場に置かれているカラムにロードした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> 図2：のMoDCの形態学的特徴付け。 （A）GM-CSFおよびIL-4の200 ng / mlでの未成熟のMoDCを生成するために0日目、4および6の精製CD14 +単球に添加されます。そして5日目（B）100 nMのビタミンD3と10 nMのデキサメタゾンでの刺激の付加的なステップは、寛容原性のMoDCを生成します。未熟たMoDCと寛容原性のMoDCは（C）成熟したMoDCおよび（D）LPS-寛容原性のMoDCを生成するために、6日目に1μg/ mlのLPSで刺激されています。ttps：//www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> 図3：フローサイトメトリー寛容原性で表面マーカーHLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD11、CD14、BDCA3とLT3の発現レベル（緑）、LPS-寛容原性（黒）、未成熟（赤） による表面マーカーの特性評価 、成熟した（青）のMoDC。アイソタイプコントロールはグレーで表示されています。各細胞型のための個々のヒストグラムは、フルオロフォアの強度と重ねのX軸対数に対してY軸細胞数でプロットされています。すべてのヒストグラムには、4つの独立した実験の代表です。 10.4049 / jimmunol.1303316（2015年6月1日）：この図は、J Immunol 194（11）、5174から5186、DOIから変更されています。再生して著作権の許可を得て再版。 著作権2015年のアメリカ協会の免疫学者、Inc.は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> 図4：のMoDCの機能解析。 （A）寛容原性の増加数との共培養により誘導されたCD4 + T細胞のalloproliferation周波数の定量（TOL;緑）、LPS-寛容原性（L-TOL;黒）、未熟（IMM;赤）と成熟（MAT ;青）のMoDC。データは、4つの独立した実験からプールしました。ダネット多重比較ポストテストとの双方向ANOVAによって分析した成熟したMoDCに対するすべてのMoDCの間+ SEMの統計的な差を意味する。IFN-Γ（左パネル）、IL-12p40の（中央のパネル）およびIL-の（B）サイトカイン分析10（右ペインいずれかの寛容原性（緑）、未成熟（赤）または成熟（青）のMoDCの数の増加と共培養したCD4 + T細胞との間のalloreactionsの上清中のL）。データは、6つの独立した実験からプールしました。 ±SEM（C）CD4 + T細胞alloproliferation及び免疫寛容のMoDCの数を増加させるの存在下で成熟したMoDCとの共培養によって誘導された調節性T細胞の拡大を意味します。左Y軸、CD4 + T細胞増殖の頻度。右側のY軸は、増殖性CD4 + T細胞上でゲーティングCD25 高のFoxp3 +細胞の頻度。データは3つの独立した実験からプールしました。 ±SEMをダネット多重比較ポストテストで一方向ANOVAによって分析した寛容原性のMoDCの不在対存在との間の統計的な差を意味する。（D）CD4 + T細胞alloproliferation（左）とCD25highFoxP3 +細胞の頻度（右）共同によって誘発されます寛容原性のMoDCと文化成熟したMoDC数の増加の存在下で実施されます。データは、2〜3の独立した実験からプールしました。成熟したMoDCの不在対存在との間に±SEMの統計的な差はダネット多重比較ポストテストとの双方向ANOVAによって分析した意味。 10.4049 / jimmunol.1303316（2015年6月1日）：この図は、J Immunol 194（11）、5174から5186、DOIから変更されています。再生して著作権の許可を得て再版。 著作権免疫学者の2015年ザ・アメリカン協会、Inc.は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> 図5：のMoDCのミトコンドリア活性の分析。 （A）のMoDCにおけるミトコンドリア膜電位のレベル（赤CMXRos）はFによって得られました低いサイトメトリー分析。 4つの独立した実験のデータをプールしました。 ±SEM（B）リアルタイムミトコンドリア呼吸の模式図を意味します。 OCR解析は、基礎呼吸から始まり、オリゴマイシン（複雑なV阻害）、FCCP（最大呼吸誘導）、およびロテノン/混合物をアンチマイシン（電子伝達系[ETC]阻害）を添加した後。ミトコンドリアSRC（最大呼吸から差し引か最大の基礎）はOCR曲線から導出される。（C）寛容原性（TOL、緑）におけるミトコンドリアOCR（ピコモル/分）の代表的な動力学的研究、LPS-寛容原性（L-TOL、黒） 、未熟（IMM、赤）とのMoDCの基礎呼吸のオリゴマイシン（Olig）、FCCP、およびロテノン/アンチマイシンA（腐-AA）。（D）OCRの定量化の逐次付加を使用することによって（MAT、青）のMoDCを成熟し、（たMoDCのE）予備の呼吸容量。データは、5つの独立した実験からプールしました。平均±SE10.4049 / jimmunol.1303316（2015年6月1日）：M.この図は、J Immunol 194（11）、5174から5186、DOIから変更されています。再生して著作権の許可を得て再版。 著作権免疫学者の2015年ザ・アメリカン協会、Inc.は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> 図6：のMoDCの代謝特性評価。 （A）リアルタイム解糖の略図。 ECAR分析は、（最大細胞解糖および複合体V阻害を誘導する）オリゴマイシン、細胞をグルコース（糖誘導）を添加したグルコースを含まない培地中でインキュベートされた基底ECARから開始し、最終的に2-デオキシD-グルコース（解糖阻害）。解糖依存の解糖率（解糖誘導は基礎ECARのために減算）、解糖能力（基礎ECARのために差し引か最大の解糖）、解糖リザーブ（解糖の誘導のために差し引か最大の解糖）ECAR曲線から導出される。（B）代表動力学的研究ECAR寛容原性で（MPH /分）（緑TOL）、LPS-寛容原性（黒L-TOL）、未成熟（赤IMM）、およびグルコース（Glucを）の逐次添加を使用することによって（MAT、青）MoDCを成熟、オリゴマイシン（Olig）、および2-DG。（C）バーは、基礎ECARレベル（D）を示す解糖率（E）解糖能力、および（F）のMoDCの解糖リザーブ。データは3つの独立した実験からプールしました。 6 SEMを意味します。統計的な差は、Tukeyの多重比較事後テストで一方向ANOVAによって分析しました。この図は、J Immunol 194（11）、5174から5186、DOIから変更されている：10.4049 / jimmunolを.1303316（2015年6月1日）。再生して著作権の許可を得て再版。 著作権免疫学者の2015年ザ・アメリカン協会、Inc.は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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