Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00
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Le travail est soutenu par CPRIT Research Training Award RP140105, ainsi que partiellement pris en charge par les Instituts américains nationaux de la santé (NIH) des subventions R01 GM114142 et par la Fondation William et Ella Owens Medical Research.

Tous les tissus sont obtenus suite à l&#39;approbation du comité Institutional Review Board et quand tous les participants ont consenti à la fois des analyses moléculaires et des études de suivi. Les protocoles sont approuvés par le Comité des études humaines à l&#39;Université du Texas Health Science Center à San Antonio. 1. Méthyl-liaison à l&#39;ADN de capture (MBDCap) <ol><li> Collecte des échantillons et l&#39; isolement de l&#39; ADN <ol><l...

<ol>
	<li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine.">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li><li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+(MeDIP)+and+methyl-CpG+binding+domain+(MBD)+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias.">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li><li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+DNA+methylation+profiling.">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li><li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip((R))+for+methylome+profiling.">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233 (2012).</li><li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling:+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip.">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li><li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing.">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li><li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome.">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li><li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq.">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LOcating+non-unique+matched+tags+(LONUT)+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data.">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788 (2013).</li><li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMS:+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers.">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980 (2013).</li><li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W-ChIPeaks:+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data.">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer.">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).</li><li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer.">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li><li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis.">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li><li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications:+cytosine+methylation+and+beyond.">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li><li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BayMeth:+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach.">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35 (2014).</li></ol>

La technique MBDCap-seq est une approche d&#39;enrichissement d&#39;affinité 3, considéré comme une alternative rentable lors d&#39; enquêtes sur des cohortes avec un grand nombre de patients 15. Le pipeline présenté ici décrit une approche globale de l&#39;échantillon achats à l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données. L&#39;une des étapes les plus importantes est la mise en place d&#39;une procédure d&#39;amplification par PCR pour améliorer l&#39;efficacité de la PCR des régions du GC enrichi...

La régulation épigénétique de gènes par méthylation de l&#39; ADN est l&#39; un des mécanismes essentiels nécessaires pour déterminer le sort de la cellule par la différenciation stable de différents types de tissus dans le corps 1. Dysrégulation de ce processus a été connu pour causer diverses maladies , dont le cancer 2. Ce procédé implique essentiellement l&#39;addition de groupes méthyle sur le résidu cytosine dans les dinucléotides CpG d&#39;ADN 3. Il y a quelques différentes techniques actuellement utilisées pour étudier ce mécanisme, chacun ayant ses propres avantages , comme indiqué dans de nombreuses études 2-8. Ici, nous allons discuter de l&#39;une de ces techniques appelées Methyl-Binding séquençage d&#39;ADN de capture (MBDCap-seq), où nous utilisons une technique d&#39;enrichissement d&#39;affinité pour identifier les régions méthylés de l&#39;ADN. Cette technique se fonde sur la capacité de méthyle de liaison de la protéine MBD2 pour enrichir les fragments d&#39;ADN génomique contenant des sites CpG méthylés. Nous utilisons un kit d&#39;enrichissement de l&#39;ADN méthylé commercialpour l&#39;isolement de ces régions méthylées. Notre laboratoire a examiné des centaines d&#39;échantillons de patients avec cette technique et ici nous fournir un protocole optimisé complet, qui peut être utilisée pour étudier les grandes cohortes de patients. Comme on le voit avec toute technologie de séquençage de nouvelle génération, MBDCap-seq exige également une approche bioinformatique spécifiques afin de quantifier avec précision les niveaux de méthylation dans les échantillons. Il y a eu de nombreuses études récentes dans le but d&#39;optimiser le processus des données de séquençage 9, 10 normalisation et d&#39; analyse. Dans ce protocole, nous démontrons une de ces méthodes de mise en œuvre d&#39;une approche unique de récupération de lecture - LONUT - suivie par la normalisation linéaire de chaque échantillon afin de permettre des comparaisons impartiales à travers un grand nombre d&#39;échantillons de patients.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methylminer DNA enrichment Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ME10025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112-05D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus Sonication Device</td>
			<td>diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIworks Fragment Library System I</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A50100</td>
			<td>Fully automated library construction system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Primers</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>514104</td>
			<td>PCR primer mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Fluorometric Quantitation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td>KAPA scientific</td>
			<td>KK2621</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

La méthylation est l&#39;une des modifications épigénétiques essentielles à l&#39;ADN, qui est responsable de la régulation précise des gènes nécessaires à un développement stable et la différenciation des différents types de tissus. Dysrégulation de ce procédé est souvent la caractéristique de diverses maladies telles que le cancer. Ici, nous présentons l&#39;une des techniques de séquençage récents, Methyl-Binding séquençage d&#39;ADN de capture (MBDCap-seq), utilisé pour quantifier la méthylation dans divers tissus normaux et pathologiques pour les grandes cohortes de patients. Nous décrivons un protocole détaillé de cette approche d&#39;enrichissement d&#39;affinité avec un pipeline de bioinformatique pour obtenir une quantification optimale. Cette technique a été utilisée pour séquencer des centaines de patients à travers divers types de cancer comme une partie du projet de méthylome 1000 (Système méthylome Cancer).

Nous avons utilisé MBDCap-seq pour étudier les altérations de méthylation d&#39; ADN dans un grand nombre de patients atteints de cancer à partir de types divers , y compris 12 sein, de l&#39; endomètre 13, 14 de la prostate et des cancers du foie , entre autres. Ici , nous démontrons quelques informations de l&#39;étude sur le cancer du sein publiée récemment 12. Dans ce cas, nous avons utilisé toute l&#39;approche de séquençage du génome pour identifier les îlots CpG qui sont diff...

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l&#39;ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l&#39;ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

La purification de l&#39;ADN de haut poids moléculaire Génomique de oïdium pour le séquençage de longue Lire

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Recherche

Génétique

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Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

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