Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00
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이 작품은 CPRIT 연구 교육 상 RP140105에서 지원뿐만 아니라 부분적으로 건강의 미국 국립 보건원 (NIH) R01 GM114142을 부여하여 윌리엄 &amp; 엘라 오웬스 의학 연구 재단이 지원됩니다.

모든 조직은 임상 시험 심사위원회위원회의 승인을 다음과 얻어진 모든 참가자가 분자 분석과 후속 연구에 모두 동의 할 때. 프로토콜은 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 인간 연구위원회에 의해 승인됩니다. 1. 메틸 결합 DNA 캡처 (MBDCap) <ol><li> 샘플 수집 및 DNA 분리 <ol><li> 환자 파라핀 조직 샘플에서 대량 종양 또는 정상 조직 샘플을 수집합니다. </li><li> 제조 ?...

<ol>
	<li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine.">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li><li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+(MeDIP)+and+methyl-CpG+binding+domain+(MBD)+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias.">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li><li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+DNA+methylation+profiling.">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li><li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip((R))+for+methylome+profiling.">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233 (2012).</li><li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling:+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip.">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li><li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing.">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li><li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome.">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li><li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq.">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LOcating+non-unique+matched+tags+(LONUT)+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data.">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788 (2013).</li><li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMS:+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers.">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980 (2013).</li><li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W-ChIPeaks:+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data.">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer.">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).</li><li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer.">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li><li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis.">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li><li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications:+cytosine+methylation+and+beyond.">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li><li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BayMeth:+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach.">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35 (2014).</li></ol>

MBDCap-SEQ 기술은 환자 (15)의 다수 집단을 조사 할 때 비용 효율적인 대안으로 고려 친 화성 농축 방법 (3)이다. 여기에 제시된 파이프 라인은 데이터 분석 및 해석에 샘플 조달에서 포괄적 인 접근 방식을 설명합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 DNA 메틸화가 발생하는 곳이므로 게놈에서 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키기 위해 PCR 증폭 과정을 설정한다. 또한, 시퀀싱 후, 각각의 샘플이 유일하게...

DNA 메틸화를 통해 유전자의 후생 유전 학적 조절은 본체 (1)의 서로 다른 조직 유형의 안정에 의해 분화 세포의 운명을 결정하기 위해 필요한 필수 메커니즘이다. 이 과정의 이상 조절이 암을 비롯한 다양한 질환을 일으키는 것으로 알려져있다. 이 프로세스는 주로 DNA (3)의 CpG 디 뉴클레오티드의 시토신 잔기에 메틸기의 첨가를 포함한다. 현재 많은 연구 2-8에서 설명한 바와 같이 각각 자신의 장점을 갖는 이러한 메카니즘을 조사하기 위해 사용되는 몇 가지 방법이있다. 여기에서 우리는 우리가 DNA의 메틸화 지역을 식별하는 친 화성 농축 기술을 사용 (MBDCap-SEQ) 메틸 바인딩 DNA 캡처 순서라는 이러한 기술 중 하나를 설명합니다. 이 기술은 메틸화 된 CpG 부위를 함유하는 게놈 DNA 단편에 대한 농축하는 MBD2 단백질 메틸 결합능에 만든다. 우리는 상업 메틸화 된 DNA 농축 키트를 활용이러한 메틸화 영역의 분리를위한. 우리의 실험은이 기술을 사용하여 환자 샘플 수백 스크리닝하고 여기 큰 환자 집단을 조사하는데 사용될 수있는 최적화 된 광범위한 프로토콜을 제공한다. 모든 차세대 시퀀싱 기술 명백한 바와 같이, MBDCap-SEQ 또한 정확하게 샘플 통해 메틸화의 수준을 정량화하기 위해 특정 바이오 인포 매틱스 방법을 필요로한다. 시퀀스 데이터 (9), (10)의 정규화 및 분석 프로세스를 최적화하기 위해 많은 최근의 연구가 있었다. LONUT - - 환자 샘플의 다수에 걸쳐 편향 비교를 가능하게하기 위해, 각 샘플의 선형 정규화 뒤에이 프로토콜에서는 고유 판독 복구 방식을 구현하는 방법 중 하나를 보여준다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methylminer DNA enrichment Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ME10025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112-05D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus Sonication Device</td>
			<td>diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIworks Fragment Library System I</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A50100</td>
			<td>Fully automated library construction system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Primers</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>514104</td>
			<td>PCR primer mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Fluorometric Quantitation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td>KAPA scientific</td>
			<td>KK2621</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

메틸화 다른 조직 유형의 안정 발생과 분화에 필요한 유전자의 정확한 조절을 담당하는 DNA에 필수적인 후생 변형 중 하나이다. 이 과정의 이상 조절은 종종 암과 같은 다양한 질환의 특징이다. 여기서, 우리는 최근 시퀀싱 기술을 간략 메틸 - 바인딩 많은 환자 집단에 대한 다양한 정상 및 질병 조직에 메틸화를 정량화하는 데 사용되는 캡쳐 DNA 시퀀싱 (MBDCap-SEQ)를. 우리는 최적의 정량화를 달성하기 위해 생물 정보학 파이프 라인과 함께이 친 화성 농축 방법의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 1000 methylome 프로젝트 (암 Methylome 시스템)의 일부로서 다양한 종류의 암 환자에 걸쳐 수백 시퀀스 사용되고있다.

우리는 그 중에서도 유방 12, 13, 자궁 내막, 전립선 (14), 및 간암 등 다양한 종류의 암 환자에서 다수의 DNA 메틸화 변화를 연구 MBDCap - 배열을 사용했다. 여기에서 우리는 최근에 12 게시 된 유방암 연구에서 몇 가지 정보를 보여줍니다. 이 예에서, 우리는 다른 차등 게놈 영역에 걸쳐 정상에 대해 종양 메틸화 된 CpG 섬을 식별 총 유전체 방식을 사용 하였다. 조사는 개 가운데 유전자 ...

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

연구

유전학

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...